Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Клонирование > Лигирование.

Лигирование.



  • Дефосфорилирование можно проводить прямо после рестрикции (не переосаждая). CIP работает в следующих буферах компании New England Biolabs: NEBuffer 2, 3, 4 (и для EcoR I, BamH I, Sal I).
  • а) (optional) инактивировать теплом рестриктазу;
    б) + CIP*, 30'-1h 37oC;
    в) очистка на форезе.

    * 0.1u/pmol 5' концов (~1µg 3kb фрагмента); для 3' и тупых концов брать в 10 раз больше. Разводить CIP в 1х буфере перед применением. Если буфер не подходит его можно быстро заменить на спин-колонке (лучше после инактивации рестриктазы).

  • При лигировании существует оптимум концентраций вставки и вектора (использование слишком низких концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких - преимущественное образование конкатамеров).
  • 1µg/ml< Coпт(Vector + Insert) <7µg/ml,

    Сильное ингибирование, если C>10µg/ml.

  • Оптимально, если вектор дефосфорилирован, а Insert/Vector <1.
  • При лигировании лучше не использовать to=+4oC. Лучше лигировать:
  • * тупые концы: 14oС ON,
    * липкие: 14-16oС ON (для библиотек); NT (на столе) 1-2h для рутинного лигирования.

  • Введение в лигазную смесь 5% PEG приводит к повышению скорости лигирования в 3-6 раз.
  • ATP можно добавить непосредственно к лигазе до 5-10mM.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100