Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Клонирование > Преципитация нукл. кислот спиртом.

Осаждение ДНК (РНК) этанолом.

Преципитация EtOH - это группа сходных методов, причём все эти методы работают более или менее хорошо. Выбор конкретной процедуры обычно определяется традициями и предрассудками (мы здесь не исключение).

  1. довести концентрацию соли до:
  2. AcNH4 => 2.0M
    LiCl => 0.8M
    NaCl => 0.2M
    AcONa => 0.3M;

  3. если требуется добавить какой-либо соосадитель (линейный PAA, tRNA, гликоген);
  4. + 2.5V 96% EtOH (имеется в виду объём вместе с солью);
  5. инкубировать от {NT, 5'} до {-20oС, ON} в зависимости от концентрации DNA;
  6. ЦФ от {14krpm, NT, 5'} до {27krpm, 4oС, 1-2h} в зависимости от концентрации DNA;
  7. 1-2x сполоснуть 70% EtOH;
  8. растворить в TE, H2O или каком либо водном буфере.


    Комментарии.

    Общие.

  • Суть метода: DNA (RNA) агрегирует в 70% EtOH в присутствии соли (агрегация проходит лучше на пониженной температуре и для неё требуется некоторое время). Затем образовавшиеся агрегаты осаждаются центрифугированием.
  • На всякий случай напомним, что DNA (RNA) в растворе это не кислота, а соль и катион у неё тот же, что и у соли, использованной для осаждения.
  • Непроверенная информация Было показано, что понижение температуры и увеличение времени инкубации от {0oС, 15'} в (п. 4) не оказывает заметного влияния на эффективность осаждения (для >20ng/ml). Наиболее заметный эффект даёт увеличение времени центрифугирования {до ~1h при 4oС}.
  • Осаждение улучшается, если добавить MgCl2 до 10mM.
  • Копреципитация:
  • фосфаты >1mM,
    EDTA >10mM.

  • Этанол (96% и 70%) и изопропанол нужно хранить в плотно (!!!) закрывающихся ёмкостях. Дело в том, что только 40% водка на открытом воздухе не меняет концентрацию спирта. Все, что имеет больший процент - обводняется. Рабочие аликвоты удобно хранить при -20oС. Сразу два преимущества: (i) раствор с DNA быстрее становится холодным; (ii) в морозильнике меньше проблем с обводнением.
  • По пунктам.

    п. 1.

    Тип и концентрация моновалентных катионов.

    1. NH4Ac - сток: 10.0M; рабочая концентрация: 1.6-2.5M. Часто используют, чтобы уменьшить копреципитацию dNTPs (2-кратное переосаждение приводит к удалению ~99% dNTP’s). Слабо осаждает полисахариды.
    2. Ограничение: ионы NH4+- ингибиторы полинуклеотидкиназы.

    3. LiCl - сток: 8.0M; рабочая концентрация: 0.8M. Хорошо растворим в спиртовых растворах и используется, когда требуются высокие концентрации EtOH. LiCl (без EtOH) селективно осаждает длинную RNA.
    4. Ограничение:ионы Li+- ингибиторы cell-free трансляции и обратной транскрипции.

    5. NaCl - сток: 5M; рабочая концентрация: 0.2M. Применяется для осаждения DNA из растворов, содержащих SDS (другие соли высаживают SDS существенно лучше).
    6. NaAc - сток: 3.0 (pH5.2), рабочая концентрация: 0.3M. Обычная преципитация DNA.

    п. 2.

    Соосадители.

  • Соосадители применяются для преципитации малых количеств DNA (RNA) и приводят к сразу двум полезным эффектам:
  • * улучшается эффективность осаждения,
    * осадок становится заметным, уменьшается вероятность его случайной потери.

  • Перечисленные ниже соосадители благополучно выдерживают экстракцию органическими растворителями (т.е. остаются в водной фазе при такой экстракции).
  • Самый главный критерий при выборе соосадителя - нужно, чтобы он не мешал последующему применению DNA (RNA). Например, tRNA может ингибировать связывание с белками, мешает дефосфорилированию и спектрофотометрическому определению концентрации.
  • (1)

    tRNA - cток: 10µg/µl, (хранить при -20oС), рабочая концентрация - 5-10µg/ml (но не менее 5µg на осаждение);

    (2)

    линейный РАА - cток: 2.5µg/µl, (хранить -20-4oС), рабочая концентрация - 10-20µl/ml (но не менее 10µg на осаждение). Линейный PAA хорошо осаждает от 20bp, практически не осаждает <10bp. Можно использовать для селективный преципитации меченных олигонуклеотидов. Не поглощаетUVв диапазоне 260-280nm.

    Приготовление линейного РАА.

    1. приготовить смесь:
    2. Конц.Сток1ml
      AA5%тв.50mg
      Tris Cl, pH 7.840mM1M40µl
      AcONa20mM3M6.6µl
      EDTA1mM0.5M2.0µl
      H2O mQ901µl
    3. добавить
    4. 1/100V 10% PSA => 10µl,   
      1/1000V TEMED => 1µl;   

    5. полимеризация 30';
    6. + 2.5V EtOH, смешать;
    7. Ц.Ф.;
    8. растворить в 20ml H2O (до 2.5µg/µl), лучше на качалке;
    9. хранить при -20-4oС.

    (3)

    гликоген: рабочая концентрация 50µg/ml. Удобно использовать 20х раствор:

    EDTA 0.2M
    гликоген 1µg/µl,

    (хранить при -20oС). Если применяется гликоген, не инкубировать при пониженной температуре в п.4 (!!!), иначе в осадок выпадет и нежелательные компоненты. Хорошо смешать и сразу центрифугировать NT, 20'. Не поглощает UV в диапазоне 260-280nm.

    Непроверенная информация Приготовление гликогена.

      Коммерческий гликоген молекулярно биологического качества весьма дорог, правда расходуется он очень медленно и, вероятно, вам удастся его у кого нибудь "стрельнуть". Если нет, можно приготовить самому.

    1. растворить 5g гликогена (from Oyster, Sigma G8751) в 10ml H2O;
    2. Ф; Х;
    3. осадить, добавив 1V EtOH;
    4. ЦФ, подсушить;
    5. взвесить осадок и растворить в H2O в концентрации 20mg/ml;
    6. хранить при –20oС в 1ml аликвотах.

    п.3.

  • Вместо этанола можно использовать изопропанол. В этом случае добавляется не 2.5V а 1V. Изопропанольное осаждение имеет только одно преимущество перед этанольным - пробирки могут быть меньшего объема. Основной недостаток - изопропанол менее летуч и промывка 70% EtOH обязательна.
  • п. 4.

    Температура преципитации.

    * если концентрация >20ng/ml => 0oС, 15-30'.
    * для низкой концентрации или маленьких размеров (~100bp) => + MgCl2до 10mM, -20oС, 1h.

    п. 5.

    Время и скорость центрифугирования.

    * если концентрация >20ng/ml => 10kg, 10-15', 4oC;
    * меньшие концентрации, малые фрагменты: 1-2h, 4oC, 27krpm.

  • Осадок DNA часто не виден. При осаждении в угловом роторе стоит отметить сторону, на которой потом нужно будет искать осадок (или ориентировать подписанные пробирки надписью от центра). Когда мы используем 0.2-2.0ml пластиковые пробирки, мы ВСЕГДА (это уже привычка) ориентируем их в центрифуге "хвостиками" наружу.
  • п.6.

  • Промывка 70% EtOH удаляет избыток соли и остатки исходного буфера.В случае массивных осадков недостаточно просто налить и убрать 70% EtOH. Необходимо встряхивать ~1'.
  • п. 7.

  • DNA, особенно длинная (например, геномная, даже расщепленная рестриктазой), очень плохо растворяется, если ее пересушить (особенно не рекомендуем высушивать DNA под вакуумом, кроме всех прочих проблем при этом DNA короче ~400bp ещё и денатурирует). Мы поступаем следующим образом: после осаждения (или промывки 70% EtOH) сбрасывается супернатант. На стенках пробирки неизбежно остаются капли. Если ждать, пока они высохнут, осадок наверняка пересохнет. Поэтому мы проводим краткое (30'') центрифугирование и вытянутым типчиком удаляем жидкость рядом с осадком. Сразу после этого DNA можно растворять.
  • Если все же случилось так, что DNA пересушена и осадок растворяется плохо, может помочь или прогрев до ~70oС, или замораживание на -20oС, а затем оттаивание. Но все это - силовые меры, до которых лучше дело не доводить.
  • Особенно серьёзными проблемы с растворимостью могут быть, если используется буфер с высокой ионной силой. Поэтому, если требуется получить раствор DNA(RNA) в буфере с высокой ионной силой, лучше вначале растворить нуклеиновую кислоту в буфере с низкой ионной силой и лишь затем поднять концентрацию соли.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100