Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Выделение ДНК из агарозного геля > С помощью DEAE-целлюлозы.

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью DEAE-целлюлозы.

Метод дёшев, удобен тем, что можно одновременно элюировать очень много полосок (хоть весь гель - электроблоттингом).

  1. провести форез в геле с 0.5µg/ml EtBr;
  2. сделать разрез перед полосой под длинноволновым UV (360 nm);
  3. вырезать DEAE-мембрану на 2mm шире полосы DNA, обработать:
  4. 5' в 10mM EDTA (pH 8.0),
  5. 5' в 0.5N NaOH,
  6. как следует отмыть в mQ,
  7. перед использованием сполоснуть в 1xТАЕ;
  8. тупым пинцетом вставить мембрану перед полосой;
  9. вогнать DNA в мембрану;
  10. сполоснуть мембрану в LSB;
  11. поместить её в 0.5ml пробирку, + HSB, чтобы полностью покрыть мембрану;
  12. 65oС, 15';
  13. проткнуть пробирку, вставить в 1.7ml пробирку, ЦФ 1';
  14. проконтролировать, что DNA не осталась на DEAE целлюлозе (UV, 360nm);
  15. экстрагировать Ф:Х, Х;
  16. + 2V EtOH;
  17. осадить;
  18. сполоснуть 70% EtOH.
  19. растворить в воде или TE.

    Растворы.

    LSB

    low salt buffer, (хранить при +4oС):

    Конц.Сток1ml50ml
    TrisCl (pH8.0)50mM1M50µl2.5ml
    EDTA10mM0.5M20µl1.0ml
    NaCl0.15M5M30µl1.5ml
    H2O mQ0.9ml45.0ml

    HSB

    high salt buffer, (хранить при NT, +4oС):

    Конц.Сток1ml50ml
    TrisCl (pH8.0)50mM1M50µl2.5ml
    EDTA10mM0.5M20µl1.0ml
    NaCl1.0M5M0.2ml10.0ml
    H2O mQ0.73ml36.5ml

    EDTA 10mM

    (хранить при +4oС):

    Конц.Сток1ml50ml
    EDTA10mM0.5M20µl1.0ml
    H2O mQ0.98 ml49.0ml

    NaOH

    0.5M, (хранить при NT) в плотно завинчивающейся посуде

    Конц.Сток1ml50ml
    NaOH0.5M10M50µl2.5ml
    H2O mQ0.95ml47.5ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Принцип метода: отрицательно заряженная DNA адсорбируется на положительно заряженный DEAE ионообменник в низкосолевом буфере и снимается с него в высокосолевом буфере при повышенной температуре.
  • Метод нельзя использовать для выделения одноцепочечной DNA - плохо снимается.
  • Эффективно выделяются фрагменты длиной <5kbp, метод непригоден для выделения фрагментов > 15kbp.
  • По пунктам.

    п. 2.

  • Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:
  • 3.2kb~ 4 раза
    4.8kb~ 30 раз
    8.2kb~ 500 раз

    п. 6.

  • Мембрану можно хранить несколько недель в mQ.
  • п. 8.

  • Непроверенная информация Можно заморозить мембрану в жидком азоте и пока бумажка твердая воткнуть её в гель.
  • п. 11 - 13.

  • Элюция DNA с мембраны.
  • п. 13.

  • DNA можно хранить в HSB несколько дней при 4oС или любое время при -70oС.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100