Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Выделение ДНК из агарозного геля > С помощью диализного мешка.

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью диализного мешка.

метод позволяет выделять фрагменты DNA любой длины.

    Выделение ДНК из агарозного геля.

  1. вырезать полосу из геля под длинноволновым UV (360 nm);
  2. поместить в диализный мешок, расположить его перпендикулярно электрическому полю;
  3. "выгнать" DNA из геля на стенку мешка, переключить ток на 15'' в обратную сторону;
  4. извлечь из диализного мешка буфер;
  5. довести NaCl до 0.1M;
  6. экстрагировать Ф, Ф:Х, Х;
  7. добавить
  8. 1/4V 10M AcONH4,
    2V EtOH, осадить;

  9. сполоснуть 70% EtOH;
  10. растворить в воде или TE.
  11. Приготовление диализных трубок.

    для большинства задач можно использовать мембрану прямо из рулона после смачивания и ополаскивания водой. При необходимости, глицерол-, серо-содержащие компоненты и тяжелые металлы могут быть убраны следующим образом:

  12. отрезать трубку необходимой длинны;
  13. смочить и кипятить 2-5' (либо вымачивать без кипячения по 30') в большом избытке10mМ бикарбоната натрия;
  14. 2х кипятить 2-5' (либо вымачивать без кипячения по 30') в большом избытке 10mМ EDTA;
  15. несколько раз сполоснуть H2O;
  16. хранить в 20-50% EtOH, +4oC.

    Растворы.

    NaHCO3

    Mr=84.01g/M; (хранить при NT).

    Конц.Сток50ml200ml300ml
    NaHCO31M84.01g/M4.20g16.80g25.20g
    H2O mQ48.96ml195.84ml293.76ml

    p=1.063.



    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 1.

  • Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:
  • 3.2kb~ 4 раза
    4.8kb~ 30 раз
    8.2kb~ 500 раз

    п. 3.

  • Переключение тока в обратную сторону делается для того, чтобы DNA не "прилипла" к стенке диализного мешка.
  • п. 5.

  • Если концентрация соли низкая, то DNA может уходить из водной фазы при экстракции фенолом.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100