Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Выделение ДНК из агарозного геля > С помощью LMP-агарозы.

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью LMP-агарозы.

Метод позволяет выделять фрагменты ~0.2-15kbp с эффективностью ~80%.

  1. либо залить полностью LMP- гель, либо вырезать лунку перед нужной полосой (под длинноволновым UV 365nm), заполнить её LMP/1xTAE и вогнать полосу в LMP;
  2. вырезать нужный кусок геля, взвесить;
  3. + TE, чтобы финальный % агарозы стал <0.5%;
  4. довести NaCl до 0.1M;
  5. 67oC, 10' время от времени перемешивая;
  6. охладить до NT;
  7. экстрагировать Ф (встряхивать 1-3');
  8. ЦФ 1.6kg (~4-5krpm), NT, 3';
  9. ЦФ NT, 5';
  10. экстрагировать Ф:Х, Х;
  11. добавить
  12. 1/4V 10M AcONH4,
    2V EtOH, осадить;

  13. сполоснуть 70% EtOH;
  14. растворить в воде или TE.


    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 1.

  • Гели из LMP-агарозы имеют меньшую разрешающую способность, чем гели из нормальной агарозы. К тому же LMP агароза существенно дороже. Обе эти причины часто делают второй способ более предпочтительным. Мы храним 0.5% LMP/1xTAE/EtBr на 4oC в 50ml пробирке, а перед применением плавим ее на кипящей бане.
  • Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:
  • 3.2kb~ 4 раза
    4.8kb~ 30 раз
    8.2kb~ 500 раз

    п. 2.

  • Взвесить - все равно, что измерить объем, только технически проще.
  • Вырезанную полоску агарозы можно хранить несколько дней при -20oС
  • п. 4.

  • Если концентрация соли низкая, то DNA может уходить из водной фазы при экстракции фенолом.
  • п. 5.

  • Непроверенная информация Говорят, что на этом этапе можно быстро избавиться от большей части агарозы:
  • -70oС, 5';
    ЦФ.

    п. 6.

  • Непроверенная информация Почему-то нехорошо экстрагировать фенолом горячую LMP-агарозу.
  • п. 8, 9.

  • Центрифугирование выполняется в два этапа, т.к. агароза образует весьма плотную подушку, которая способна увлечь DNA в интерфазу.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100