Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Выделение ДНК из агарозного геля > С помощью "glass milk".

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью "glass milk".

Метод можно использовать для выделения/очистки как двухцепочечной, так и одноцепочечной DNA.

    Очистка DNA из агарозного геля.

  1. вырезать нужную полоску под длинноволновым UV (360 nm);
  2. взвесить;
  3. + необходимый объём "NaI";
  4. 50oС, 10' или пока вся агароза не расплавится (время от времени помешивая);
  5. проверить, что цвет раствора желтый (если красный - добавить немного (1-5µl) 3M NaOAc, pH~5);
  6. + объём изопропанола, равный объёму геля;
  7. + необходимое количество 50% SiO2
  8. мягко смешивать ~5' NT;
  9. ЦФ 5'', сбросить супернатант;
  10. не обязательно
  11. если требования к чистоте фрагмента очень высокие - сполоснуть 100-200µl "NaI";

  12. добавить 0.5ml STE/EtOH, либо пипетировать, либо вортекс, ЦФ 5'', сбросить супернатант;
  13. повторить п.11 ещё 2 раза;
  14. ЦФ 5'', тщательно убрать остатки STE/EtOH;
  15. не обязательно
  16. если DNA чистится для электропорации, дополнительно промыть 1 раз 80% EtOH.

  17. + EB в объеме, не меньшем, чем объем glass milk;
  18. вортекс 5-20'';
  19. 20о-50oС, 1-5';
  20. ЦФ 20'';
  21. перенести супернатант в новую пробирку;
  22. можно элюировать остатки DNA с glass milk ещё раз.
  23. Приготовление glass milk.

  24. в 200ml стакане суспензировать с помощью магнитной мешалки 10g Silicon dioxide в ~100ml кислоты (азотной или соляной), 2h-ON;
  25. 2x промыть ~100ml смеси (метанол:соляная кислота=1:1);
  26. в 200ml стакане суспензировать с помощью магнитной мешалки в ~150ml H2O;
  27. дать осесть под действием силы тяжести (~15'), сбросить надосадочную жидкость;
  28. повторить (п. 23, 24) 4 раза;
  29. дать осесть под действием силы тяжести 2', забрать надосадочную жидкость;
  30. осадить в 50ml пробирке (ЦФ 5krpm, 3');
  31. добавить объём H2O равный объёму SiO2, суспензировать.
  32. хранить рабочий сток (~1ml) при NT, основной - при -20oС.

    Растворы.

    STE/EtOH

    (хранить при 4oС в плотно закрытой ёмкости):

    Конц.Сток50.0ml
    Tris HCl, pH7.010mM1.0M0.5ml
    EDTA1mM0.5M0.1ml
    NaCl100mM5.0M1.0ml
    EtOH~75%~96%40.0ml
    H2O mQ8.4ml

    NaI

    (хранить при 4oС в защищенной от света ёмкости):

    Конц.Сток10ml50ml
    NaI6.6M149.9g/M9.9g49.5g
    Na2SO316mM126.04g/M0.02g0.1g
    Cresol red0.25mM10mM0.25ml1.25ml
    H2O mQ7.12ml35.6ml

    EB

    elution buffer: хранить при 4oС

    Tris HCl, 10mM, pH8.5.



    Комментарии.

    Общие.

  • Очистка на glass milk, как и на любых других silica-particles приводит к частичной денатурации DNA. Это особенно опасно в случае гетерогенной DNA. Если предполагается использование очищенного материала в процедурах, требующих, чтобы DNA была двухцепочечной (например, расщепление рестриктазами), то лучше glass milk не использовать.
  • Метод позволяет выделять фрагменты ~0.2-15kbp с эффективностью не менее 80%. Его можно использовать и для очистки DNA в водных растворах (между ферментативными реакциями, после PCR и т.п.) В этом случае процедура начинается с п.3.
  • Для фореза нужно использовать TAE буфер.
  • Принцип метода: DNA связывается с silica-particles в высокой соли. Примеси отмываются. DNA снимается Tris-буфером или водой.
  • Адсорбция зависит от pH, резко уменьшаясь при pH>7.5. Для визуального контроля в NaI вводится Cresol red: при pH<7.5 он желтый, а при pH>7.5 - красный.
  • Эффективность элюции зависит от элюирующего буфера: концентрации соли должна быть минимальной, а pH должен быть >8.0.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:
  • 3.2kb~ 4 раза
    4.8kb~ 30 раз
    8.2kb~ 500 раз
  • Непроверенная информация Можно увидеть DNA и при обычном свете, если использовать для окраски Cristal Violet (стоковый раствор 2mg/ml). В агарозный гель добавить до 0.80-1.6µg/ml (40-80µl на 100 ml); уходит из геля к отрицательному полюсу. Образец наносить, добавив 6х Load. Buffer:
  • Glycerol => 30%
    EDTA => 20mM
    Cristal Violet => 100µg/ml.

    п. 2.

  • Взвесить - все равно, что измерить объем, только технически проще.
  • Вырезанную полоску агарозы можно хранить несколько дней при -20oС
  • п. 3.

  • Объём NaI должен быть таким, чтобы:
    1. агароза составляла<0.25% от финального объема,
    2. но не менее 3хVгеля.(или объёмов ферментативной реакции).

    например: для 0.75% геля - 3xVгеля; 1.0% - 3xVгеля; 1.5% - 5xVгеля.

    п. 4.

  • Желтый цвет NaI позволяет лучше видеть не расплавившуюся агарозу. Агароза плавится за ~5' .
  • п. 5.

  • Адсорбция DNA на частицы SiO2 зависит от pH, резко уменьшаясь при pH>7.5. Желтый цвет "NaI" соответствует pH<7.5.
  • п. 6.

  • Изопропанол улучшает адсорбцию DNA. Это особенно важно при выделении небольших (<0.7 kbp) фрагментов.
  • Непроверенная информация Для малых (<500bp) фрагментов лучше дополнительно добавить 1/20V 1% уксусной кислоты. Это приводит к понижению рН до ~ 6.5.
  • Непроверенная информация Повышение температуры до 55oС улучшает связывание.
  • п. 7.

  • Ёмкость SiO2: >2µg 3kbp линейной dsDNA на 1µl 50% суспензии, но если использовать <1µl/µg, частицы SiO2 начинают агрегировать.
  • С объемами 50% суспензии SiO2 меньшими, чем 0.5µl, работать неудобно, видимо, разумный компромисс - 2-3µl, если количество DNA меньше, чем 1µg. Если больше, то дополнительно по 2µl на каждый дополнительный микрограмм DNA.
  • Еще одно соображение, чтобы в растворе была приемлемая концентрация silica particles: для 0.5ml - минимум 8µl, для 1.0ml - минимум 16µl.
  • п. 9-13.

  • Отмывка. Смываются: праймеры, соли, белки, агароза, EtBr, масло, DMSO, детергенты.
  • п. 11.

  • В STE/EtOH SiO2 частицы ресуспензируются с трудом, вполне вероятно, что вместо Vortex придется применять пипетирование.
  • п. 13.

  • Если это необходимо, можно убрать остатки EtOH, подсушив glass milk (5-10' на столе или 2-5' под вакуумом).
  • п. 14-18.

  • Элюция DNA. DNA можно снимать с частиц в любом низкосолевом буфере, но важно, чтобы pH был в районе 7.0-8.5.
  • Прогрев особенно важен, если DNA длинная (>5kbp).
  • Если стараться забрать всю водную фазу, неизбежно захватывается некоторое количество glass milk. Для большинства применений это не опасно, т.к. SiO2-частицы слабо связывают DNA в растворах с менее, чем 3М солью. Если все же желательно избавиться от SiO2:
  • * перед использованием ЦФ полученный раствор, а аликвоту отбирать с самого верха;
    * ЦФ через ЦФ-фильтр.

  • Остаточное загрязнение NaI можно проконтролировать по UV поглощению. NaI имеет 2 максимума: один в районе 195nm, второй- 226.5nm => CNaI[µM] =74xA226.
  • п. 20.

  • Вторая элюция может дать дополнительно 10-20% DNA.
  • п. 21.

  • SiO2- Sigma, #S-5631
  • п. 22.

  • Отмывка кислотой частиц SiO2от грязи.
  • п. 23-25.

  • Отмывка от кислоты.
  • Отмывка от слишком мелких частиц SiO2.
  • п. 26.

  • Отмывка от слишком крупных частиц SiO2.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100