Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Выделение ДНК из агарозного геля > С помощью PEG/TAE.

Выделение ДНК из агарозного геля с помощью PEG/TAE.

На наш взгляд это самый удобный метод выделения DNA из геля. Он дёшев, позволяет выделить фрагменты DNA любого размера с эффективностью более 90%, очень быстр, позволяет выделить одновременно так много фрагментов, как много лунок Вы вырежете.

    Схема элюции
  1. вырезать лунку перед полосой (под длинноволновым 365nm UV), убрать лишние куски агарозы;
  2. убрать из камеры лишний буфер (может быть придётся наложить фитили из фильтровальной бумаги (см. рис.));
  3. заполнить лунку PEG/TAE;
  4. вогнать DNA в лунку 20-25v/cm, за продвижением полосы DNA следить с помощью UV лампы (360nm);
  5. собрать раствор из лунки (хранить при -20oС);
  6. хороший тон - сфотографировать после этого гель под UV.
  7. обычно дальнейшая очистка не требуется, для каких то "особо чистых" случаев:

  8. экстрагировать Ф:Х:I;
  9. ЦФ 2-3 krpm NT, 5';
  10. ЦФ NT, 5';
  11. экстрагировать Х:I;
  12. ЦФ NT, 5';
  13. добавить
  14. 1/10V 3M AcONa,
    2хV EtOH, смешать;

  15. осадить, сполоснуть 70% EtOH,
  16. растворить в воде или TE.

    Растворы.

    PEG/TAE

    (хранить при 4oС) p=1.033:

    Конц.Сток50ml
    PEG*15%тв.7.5g
    TAE1x50x1.0ml
    EtBr0.5µg/ml10µg/ml2.5µl
    H2O mQ43.1ml
    Конц.Сток50ml
    PEG*15%40%18.75ml
    20.16g

    TAE1x50x1.0ml
    EtBr0.5µg/ml10µg/ml2.5µl
    H2O mQ30.25ml

    * можно использовать PEG 6000 или 8000.



    Комментарии.

    Общие.

  • Метод основан на электроэлюции DNA из геля в буферный раствор. Чтобы DNA не проскакивала сквозь лунку, вязкость раствора повышается добавлением 15% PEG.
  • Видимо аналогичный метод может быть использован и для других форезных буферов, единственная модификация - заменить PEG/TAE на PEG/???.
  • Вариация метода: для снижения скорости движения DNA используется повышение концентрации соли в буфере. В этом случае в лунку заливается {3xTAE/EtBr}. Преимущество такого способа - буферный раствор легко можно заменить гель-фильтрацией.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:
  • 3.2kb~ 4 раза
    4.8kb~ 30 раз
    8.2kb~ 500 раз
  • Если лунки достаточно близко друг к другу, нужно быть очень внимательным, чтобы не устроить разрез между ними.
  • лишние куски агарозы легче всего убрать с помощью обрезанного желтого типчика, подсоединенного к вакуумному насосу. Если лунки небольшого размера, то вырезать их проще всего стеклянной Пастеркой, подсоединённой к вакуумному насосу. Чтобы легко видеть конец Пастерки под ультрафиолетовой лампой можно вначале "всосать" в неё немного краски с обычного лабораторного маркера.
  • п. 4.

  • Электрофорез при высокой напряженности поля выравнивает скорости движения молекул DNA разного размера.
  • За продвижением полосы DNA удобнее следить, если фон под камерой темный.
  • п. 5.

  • Если использовать для электрофореза буфер TAE, выделенную ДНК без дальнейшей очистки можно использовать для лигирования, кинирования, реакции Random Primer. Примесь PEG не ингибирует рестрикцию.
  • Примесь PEG мешает анализу выделенного фрагмента с помощью электрофореза, вызывая размытие полосы при переходе DNA из лунки в гель. Чтобы получить четкие полосы, нужно перед нанесением экстрагировать раствор DNA равным объёмом водонасыщенного X:I (24:1).
  • п. 8, 9.

  • Центрифугирование выполняется в два этапа, т.к. PEG образует весьма плотную подушку, которая способна увлечь DNA в интерфазу.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100