Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Электрофорез > Маркеры молекулярного веса (ДНК).

DNA маркеры.

Приблизительный вид в 1% геле

Вид маркера в 1% геле   

    Маркер, имеющийся в наших руках - "Supercoiled DNA ladder" - точная копия, а "1 kb DNA ladder" -модифицированная версия маркеров с тем же названием фирмы "Stratagene" #201116 и #201115, соответственно. Модификация - клонирование двух 0.25-1.5kb фрагментов вместо одного (см. ниже). Это делает маркер более однородным по интенсивности.

    Приготовление Supercoiled DNA ladder.

    (2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 12kbp)

  1. выделить pMr2, pMr3, ..., pMr12 (так, чтобы не было RNA);
  2. спектрофотометрически определить концентрации;
  3. приготовить смесь с общей концентрацией 0.5µg/µl: смешать индивидуальные компоненты так, чтобы концентрация pMr7 составила 125ng/µl, а каждой из остальных девяти плазмид - 41.7ng/µl.

    Приготовление 0.25-6kb и 7-12kb DNA ladders.

    (0.25; 0.5; 0.75; 1; 1.5; 2; 3; 4; 5; 6kbp) и (7; 8; 9; 10; 12kbp). Последовательности вставок (0.25; 0.5; 0.75; 1; 1.5kbp) приведены в заархивированном текстовом файле.

  1. выделить pMr2+2, pMr3+2, ..., pMr6+2, pMr7, pMr8, ..., pMr12 (лучше так, чтобы не было RNA);
  2. резать их по отдельности рестриктазой EcoR I; проконтролировать полноту рестрикции;
  3. чистить Ф:Х; Х; спектрофотометрически определить концентрации;
  4. приготовить смеси с общей концентрацией 376ng/µl (0.25-6kb DNA ladder) и 250ng/µl (7-12kb DNA ladder) так, чтобы концентрация индивидуальных компонентов составила:
  5. 0.25-6kb DNA ladder  7-12kb DNA ladder
    Название:Концентрация [ng/µl]:  Название: Концентрация [ng/µl]:
    pMr2+295  pMr750
    pMr3+267  pMr850
    pMr4+269  pMr950
    pMr5+270  pMr1050
    pMr6+275  pMr1250
  6. в 1µl этих смесей содержатся следующие количества фрагментов различной длины:
  7. 0.25-6kb DNA ladder  7-12kb DNA ladder
    Размер [bp] Количество [ng]  Размер [bp]Количество [ng]
    6.00050 12.00050
    5.00050 10.00050
    4.00050 9.00050
    3.00050 8.00050
    2.00076 7.00050
    1.50025 
    1.00020
    75019
    50017
    25019

    Приготовление pSKII(+)/Msp I.

    (26; 34; 57; 67; 110; 147; 157; 190; 242; 328; 404; 489; 710bp)

  8. выделить pBluescript SKII(+) (лучше так, чтобы не было RNA);
  9. резать рестриктазой Msp I; проконтролировать полноту рестрикции;
  10. чистить Ф:Х; Х; спектрофотометрически определить концентрацию;
  11. развести при концентрации 1µg/µl, концентрация индивидуальных компонентов представлена в таблице.
  12. pSKII(+)/Msp I
    Размер [bp]Количество [ng]
    710240
    489165
    404136
    328111
    24282
    19064
    15753
    14750
    11037
    6723
    5719
    3411
    269

    Приготовление маркера лямбда-конкатамеров.

  13. DNA фага лямбда (~0.1µg/ml) + 1/10V буфера для Т4 DNA ligase;
  14. 65oC , 2';
  15. охладить до 42oС за ~5';
  16. 10-20', 42oС;
  17. охладить до NT;
  18. + T4 DNA ligase;
  19. 1-4h NT;
  20. + буфер для внесения SDS(+)
  21. хранить на -20oС в аликвотах на одно нанесение.


    Комментарии.

    Общие.

  • 0.25-6kb и 7-12kb DNA ladders безусловно дешевле, удобнее в приготовлении и в использовании, чем маркеры на основе фага лямбда. У него лишь один существенный недостаток: он дает очень сильный фон при гибридизации с фрагментами (даже очищенными), клонированными в плазмидных векторах. Приходится наносить маркер через пустую дорожку от "геномных" полос и отрезать перед переносом. Кроме того, в качестве некоторых вставок были использованы фрагменты из фага лямбда (очень неудачная идея!), так что с зондами, вырезанными из лямбда-векторов этот маркер тоже фонит. Впрочем, аналогичные проблемы возникают и с лямбда/HindIII при гибридизации с фрагментами, вырезанными непосредственно из фагового вектора.
  • Все используемые плазмиды имеют слабый контроль и ампициллиновую селекцию. Приблизительный выход из 250ml LB/Amp: ~1mg (для pMr2 и pMr2+2) и ~2.6mg для всех остальных. Поэтому, для того, чтобы получить более или менее сбалансированные количества pDNA:
  • * если речь идет о приготовлении "Supercoiled marker" надо брать для pMr2 объем среды в 2 раза больший, чем для остальных плазмид;
    * если речь идет о приготовлении "1kb marker" надо брать для pMr2+2 объем среды в 4 раза больший, чем для остальных плазмид.

    Название плазмиды:Размер[bp]:Количество сайтов рестрикции EcoR I:Фрагменты, получающиеся в результате рестрикции EcoR I:Относительное количество сайтов EcoR I:Приблизи-
    тельное количество EcoR I, [u]:
    pMr2200011x2000(6)(6)
    pMr3300011x3000(4)(4)
    pMr4400011x4000(3)(3)
    pMr5500011x5000(2.4)(3)
    pMr6600011x6000(2)(2)
    pMr7700011x70001.71.5
    pMr8800011x80001.51.4
    pMr9900011x90001.31.2
    pMr101000011x100001.21.1
    pMr121200011x1200011
    pMr2+2250031x2000+2x25014.413
    pMr3+2400031x3000+2x50098
    pMr4+2550031x4000+2x7506.56
    pMr5+2700031x5000+2x10005.15
    pMr6+2900031x6000+2x150044

    По пунктам.

    п. 5.

  • Обращаем ваше внимание на то, что когда режутся приблизительно одинаковые массы плазмид, молярное количество EcoR I сайтов в реакции сильно различается. Кроме того, EcoR I относится к тем рестриктазам, которые способны работать и в течении ночи, т.е. количество фермента может быть уменьшено В таблице приведены приблизительные количества EcoRI, необходимые для того, чтобы порезать ON 100µg соответствующих плазмид.
  • п. 3, 7.

  • Лучше, перед тем как смешивать большой объём маркера развести индивидуальные компоненты (понемногу!!!) до конечной концентрации и проконтролировать на форезе, что получилось.
  • 0.25-6kb и 7-12kb DNA ladders можно при желании объединить в один 0.25-12kb DNA маркер.
  • Для получения отчетливой картинки достаточно наносить 0.2-0.5µl смеси на одну дорожку геля.
  • Мы предпочитаем хранить основной сток в морозильнике на -20oС и готовить из него по мере необходимости "рабочий сток", который держим при +4С. "Рабочий сток" составляется таким образом, чтобы 10µl давали не слишком яркую, но вполне читаемую картинку на форезе:
  •  Конц.Сток500µl
    Маркер0.015µg/µl0.5µg/µl15µl
    Буфер для внесения SDS(+)1x10x50µl
    H2O mQ435µl

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100