Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Электрофорез > Саузерн (перенос в SSC).

Перенос по Southern (в буфере с высокой ионной силой).

Буфер с высокой ионной силой применяется для нитроцеллюлозных и нейтральных или отрицательно заряженных нейлоновых мембран. Для переноса на положительно заряженные нейлоновые мембраны (такие как HybondN+) можно использовать щелочной перенос, при котором фиксация DNA на мембране происходит одновременно с переносом (Перенос по Southern (щелочной).).

  1. зарисовать маркер;
  2. отрезать 1/2 маркера, лишний гель, лунки, правый верхний угол геля;
  3. измерить и записать размер геля;
  4. качать в 0.25M HCl (+ 10' после того, как пожелтеет бромфеноловый синий);
  5. сполоснуть H2O;
  6. мягко качать в денатурирующем буфере (+ 15' после того, как бромфеноловый синий поменяет цвет) ~20';
  7. мягко качать в нейтрализующем буфере (+ 15' после того, как бромфеноловый синий поменяет цвет) ~20';
  8. в это время подготовить:
  9. * 3 куска ватмана 3MM по размеру геля;
    * 2 больших куска ватмана 3MM - на подложку;
    * мембрану Hybond N+ (размер геля +3-5mm c каждой стороны);
    * 4 ленты парафильма;
    * стопку фильтровалки;

  10. поочередно обмакнуть в 20x SSC большие куски ватмана и положить их на подложку без пузырей, опустить концы в 20x SSC;
  11. положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 20x SSC;
  12. подложить рядом ленты парафильма так, чтобы мембрана не соприкоснулась с 3MM когда гель сожмется;
  13. мембрану смочить в 20x SSC, положить на гель (без пузырей);
  14. сверху - 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 20x SSC), стопку фильтровалки, плоскую пластину и грузик (~300g для 10x10cm2геля);
  15. перенос в 20x SSC 2-16h;
  16. зарисовать на мембране карандашом границы геля;
  17. подписать мембрану;
  18. прополоскать ~5' в 2хSSC;
  19. срезать ненужные участки;
  20. фиксировать DNA ультрафиолетом UV=120mJ/cm2
  21. завернуть в Saran Wrap, хранить при NT или при -20oС.

    Растворы.

    HCl 0.25M

    (готовить перед применением)

    Конц.Сток100ml250ml500ml
    HCl0.25M37%
    (12.1M)
    2.07ml
    2.46g
    5.18ml
    6.16g
    10.35ml
    12.32g

    H2O mQ98ml245ml490ml

    Денатурирующий буфер

    (хранить при NT).

    Конц.Сток100ml300ml500ml750ml1L
    NaCl1.5M58.44g/M8.766g26.30g43.83g65.75g87.66g
    NaOH0.5M10M5ml
    6.65g
    15ml
    19.94g
    25ml
    33.23g
    37.5ml
    49.84g
    50ml
    66.45g

    40g/M2g6g10g15g20g
    H2O mQ      

    Нейтрализующий буфер

    (хранить при NT).

    Конц.Сток300ml500ml750ml1L
    Tris Cl, pH7.41M121.1g/M36.3g60.5g90.75g121.1g
    NaCl1.5M58.44g/M26.30g43.83g65.75g87.66g
    HCl~0.81M11.6M/L~21ml~35ml~52.5ml~70ml
    EDTA (optional)1mM0.5M0.6ml1ml1.5ml2ml
    H2O mQ     


    Комментарии.

    Общие.

  • SSC - не единственный возможный буфер для переноса. Было показано, что даже более хорошие результаты дает использование:
  • * NH4Ac 1M, NaP (pH 6.5) 25mM
    * или NH4Cl 1M, NaP (pH 6.5) 25mM

  • Непроверенная информация Есть сообщение, что присутствие Mg2+ ингибирует связывание DNA с мембраной при dot-blottinge (даже при ~ 1mM). Добавление EDTA до 100 mM перед денатурацией восстанавливает связывающую способность даже для 6mM MgCl2.
  • По пунктам.

    п. 4.

  • Апуринизация приводит к умеренному дроблению DNA (фрагменты большого размера (>5kbp) плохо проходят сквозь агарозу при переносе). Важно не превышать указанное время.
  • п. 9.

  • Очень удобно, когда подложка имеет размер геля. В этом случае нет нужды прокладывать парафильм в п. 10.
  • п. 10.

  • Чтобы положить гель без пузырей надо налить на подложку немного буфера для переноса.
  • п. 12.

  • Мембраны плохо (долго) смачиваются в растворах с высокой ионной силой. Если хочется сделать это побыстрее, то лучше смочить мембрану в mQ, а затем ополоснуть в 20xSSC.
  • п. 19.

  • Практически во всех руководствах пишется, что зафиксировать DNA на нитроцеллюлозной мембране можно лишь запеканием в вакууме 80oС, ~2h (кстати, для этого удобно использовать гель-драер; нейлоновые мембраны тоже можно фиксировать "запеканием", но для них вакуум не обязателен). Тем не менее мы беспроблемно фиксировали DNA на нитроцеллюлозе ультрафиолетом.
  • Непроверенная информация Можно запечь мембрану в микроволновой печи ~2.5 min при W~750-900W (нет переэкспозиции, если и в 2 раза дольше).

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100