Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Электрофорез > Саузерн (щелочной перенос).

Перенос по Southern (щелочной).

Щелочной перенос применяется для положительно заряженных нейлоновых мембран (таких как HybondN+). Фиксация DNA на мембране происходит одновременно с переносом. Для нейтральных или отрицательно заряженных мембран перенос проводится в буфере с высокой ионной силой (Перенос по Southern (в буфере с высокой ионной силой).). Фиксация проводится после переноса.

  1. зарисовать маркер;
  2. отрезать 1/2 маркера, лишний гель, лунки, правый верхний угол геля;
  3. измерить и записать размер геля;
  4. качать в 0.25M HCl (+ 10' после того, как пожелтеет бромфеноловый синий);
  5. сполоснуть H2O;
  6. мягко качать в 0.4N NaOH ~30';
  7. в это время подготовить:
  8. * 3 куска ватмана 3MM по размеру геля;
    * 2 больших куска ватмана 3MM - на подложку;
    * мембрану Hybond N+ (размер геля + 3-5mm c каждой стороны);
    * 4 ленты парафильма;
    * стопку фильтровалки;

  9. поочередно обмакнуть в 0.4M NaOH большие куски ватмана и положить их на подложку без пузырей, опустить концы в NaOH;
  10. положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 0.4M NaOH;
  11. подложить рядом ленты парафильма так, чтобы мембрана не соприкоснулась с 3MM когда гель сожмется;
  12. мембрану смочить в 0.4M NaOH, положить на гель (без пузырей);
  13. сверху - 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 0.4N NaOH), стопку фильтровалки, плоскую пластину и грузик (~300g для 10x10cm2геля);
  14. перенос в 0.4M NaOH 2-16h;
  15. зарисовать на мембране карандашом границы геля;
  16. подписать мембрану;
  17. прополоскать ~5' в 2хSSC;
  18. срезать ненужные участки;
  19. завернуть в Saran Wrap, хранить при NT или при -20oС.

    Растворы.

    HCl 0.25M

    Конц.Сток100ml250ml500ml
    HCl0.25M37% (12.1M)2.07ml
    2.46g
    5.18ml
    6.16g
    10.35ml
    12.32g

    H2O mQ98ml245ml490ml

    (готовить перед применением)



    Комментарии.

    Общие.

  • Непроверенная информация Есть сообщение, что присутствие Mg2+ ингибирует связывание DNA с мембраной при dot-blottinge (даже при ~1mM Mg2+). Добавление EDTA до 100 mM перед денатурацией восстанавливает связывающую способность даже для 6mM MgCl2.
  • По пунктам.

    п. 4.

  • Апуринизация приводит к умеренному дроблению DNA (фрагменты большого размера (>5kbp) плохо проходят сквозь агарозу при переносе). Важно не превышать указанное время.
  • п. 8.

  • Очень удобно, когда подложка имеет размер геля. В этом случае нет нужды прокладывать парафильм в п. 10.
  • п. 9.

  • Чтобы положить гель без пузырей надо налить на подложку немного буфера для переноса.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100