Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Электрофорез > Денатурирующий агарозный гель.

Щелочной агарозный гель.


  1. взвесить, расплавить нужное количество агарозы;
  2. охладить до 60oС:
  3. добавить
  4. 10M NaOH до 50mM => 5µl/ml,
    0.5M EDTA до 1mM => 2µl/ml;

  5. залить гель;
  6. к препарату DNA добавить:
  7. EDTA до 10mM
    0.2V 6x щелочного буфера для внесения.

  8. форез;
  9. для автографа:

    а) вымочить в 7% ТХУ 30',
    б) сушить (на стопке бумаги или с помощью гель-драера);

    для блота:

    а) перенос на Hybond N - нейтрализовать в буфере для нейтрализации,
    б) перенос на Hybond N+- сразу же перенос в 0.4М NaOH.

    Растворы.

    6х щелочной буфер для внесения.

    (хранить при NT):

    Конц.Сток10ml25ml
    NaOH0.3N10N300µl750µl
    EDTA6mM0.5M120µl300µl
    Ficoll 40018%тв.1.8g4.5g
    Ксилен. циан.0.25%тв.25mg62.5mg

    Ксиленцианол постепенно обесцвечивается в щелочном буфере.

    Буфер для щелочного фореза.

    (использовать свежеприготовленный):

    Конц.Сток1L
    NaOH50mM10N5ml
    EDTA1mM0.5M2ml
    H2O mQ993ml


    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 2.

  • Добавление к очень горячей агарозе NaOH вызовет ее гидролиз. Поэтому надо расплавить агарозу в воде и охладить до ~60oС.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100