Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Фаг лямбда > Выделение ДНК (качественное).

Выделение ДНК фага лямбда для приготовления вектора.


    Выделение DNA фага лямбда.

  1. заранее подготовить ночную культуру клеток: 2-3ml LTB/Mg/мальтоза, в 17ml пробирке, бактериальная качалка 200-300rpm, 30oС, ON;
  2. пастеркой выколоть бляшку в 200µl SM + капля хлороформа;
  3. 2 часа на качалке или в холодильнике ON;
  4. к 50µl клеток + 1/2 суспензии фага, 37oС, 30';
  5. фаг/клетки -> в 60ml LTB/Mg в колбе V>150ml;
  6. бактериальная качалка 250-300rpm, 6-8 часов 37oС;
  7. если прошёл "хороший лизис":

  8. + 1ml хлороформа, встряхивать 5';
  9. 54ml -> в центрифужную пробирку, охладить до NT;
  10. + DNase и RNase до 5µg/ml (по 27µl стоковых [10µg/µl] растворов);
  11. NT, 30';
  12. + NaCl (тв.) до 1М (3.15g);
  13. 0oС, 15';
  14. ЦФ 11kg, 4oС, 10';
  15. супер слить через марлю в пробирку с 5.4g PEG 8000;
  16. 0oC 1h;
  17. ЦФ 11kg, 4oС, 10', слить жидкость;
  18. ЦФ еще 3', отсосать остатки жидкости;
  19. используя пипетку с широким отверстием мягко ресуспензировать осадок в SM (1.6ml на 100ml исходной культуры);
  20. экстрагировать PEG и клетки равным объемом хлороформа: вортекс 30''; ЦФ 3kg, 4oС, 15';
  21. на каждый ml суспензии + 0.5g CsCl (тв.);
  22. Ступенчатый градиент CsCl
  23. в ультрацентрифужной пробирке приготовить ступенчатый градиент CsCl. Отметить положение границы 1.50-1.45. наслоить на градиент суспензию из п.21:
  24.   100ml или
    p [g/ml] CsCl SM n
    1.45 60g
    85ml
    1.3768
    1.50 67g
    82ml
    1.3815
    1.70 95g
    75ml
    1.3990
  25. ЦФ 22krpm, 4oС, 2h (должен быть виден слой фага лямбда);
  26. отобрать шприцом слой фага лямбда;
  27. поместить в ультрацентрифужную пробирку и заполнить ее SM/CsCl (p=1.5g/ml),
  28. (Ti 50) 38krpm, 4oC, 24 h,
    (SW 50.1) 35krpm, 4oC, 24 h;

  29. собрать шприцом слой фага лямбда, хранить при 4oС в плотно закрытой пробирке;
  30. убрать CsCl из очищенного бактериофага 2х-кратным диализом 1 час NT против 1000х объема STM;
  31. добавить:
  32. EDTA 0.5M pH8.0 до 20mM,
    ProtK 20µg/µl до 50-100µg/ml,
    SDS 10% до 0.5%;

  33. смешать, 56oС, 1-3h
  34. охладить до NT, мягко экстрагировать Ф, Ф:Х, Х;
  35. +4oС, диализ против 3х смен 1000х TE ( pH8.0), по 8h;
  36. определить концентрацию DNA.
  37. Для "векторов вставки".

    Рестрикция, дефосфорилирование, отжиг (совмещен с тепловой инактивацией рестриктазы).

  38. рестрикция (~20µg DNA лямбда);
  39. (33-38 - optional):

  40. мягко экстрагировать Ф, Ф:Х, Х;
  41. добавить

    1/10V AcONa
    2xV EtOH, осадить,

  42. промыть 70% EtOH;
  43. растворить в таком объёме TE, чтобы концентрация DNA составила 0.25-0.5µg/µl;
  44. + MgCl2до 10mM;
  45. 68oС, 5', медленно (~0.5h) охладить до 42oС (в пенопластовой бане);
  46. переставить в термостат на 42oС, 1h;
  47. добавить
  48. H2O 70µl,
    CIAP буфер 10µl,
    CIAP 1u/µl 0.7µl;

  49. 37oС, 30';
  50. добавить
  51. EDTA pH8.0 0.5M 1µl,
    ProtK 20µg/µl 1.5µl,
    SDS 10% 5µl;

  52. 56oС, 1-3h;
  53. мягко экстрагировать Ф, Ф:Х, Х;
  54. добавить
  55. 10µl AcONa,
    220µl EtOH, осадить,

  56. промыть 70% EtOH;
  57. растворить в 20µl H2O, определить концентрацию;
  58. хранить при -70oС.

    Растворы.

    STM

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    NaCl10mM5M100µl
    Tris Cl pH8.050mM1M2.5ml
    MgCl210mM1M500µl
    H2O mQ46.9ml

    TM

    (хранить при 4oС):

    Конц.Сток50ml
    Tris Cl pH8.050mM1M2.5ml
    MgCl210mM1M500µl
    H2O mQ47.0ml

    SM

    (хранить при 4oC).

    Конц.Сток10ml50ml100ml150ml
    NaCl0.1M5M200µl1.0ml2.0ml3.0ml
    MgSO4*10mM1M100µl0.5ml1.0ml1.5ml
    Tris Cl, pH7.550mM1M0.5ml2.5ml5.0ml7.5ml
    желатин0.01%2%50µl0.25ml0.5ml0.75ml
    H2O mQ9.15ml45.75ml91.5ml137.25ml

    * - добавлять после автоклавирования,
    Стерилизовать автоклавированием.



    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 1-20

  • Смотри "Выделение DNA фага лямбда".
  • п 21.

  • двукратное равновесное центрифугирование лямбда в градиенте плотности CsCl. Нужно обязательно ориентироваться по метке между p =1.5 и p =1.45 т.к. в пробирке будут и другие опалесцирующие слои.
  • п. 23, 25.

  • Можно прерваться, оставив суспензию фага на несколько суток при+4oС.
  • п. 26.

  • CsCl нужно убрать потому, что высокая концентрация соли ингибирует работу Proteinase K.
  • Бактериофаг лямбда можно хранить в CsCl при +4oС несколько лет.
  • п. 30.

  • Вместо переосаждения применяется диализ т.к. DNA фага длинная и может при переосаждении рваться.
  • п. 33-38.

  • Мы не можем уверенно сказать, какая из процедур дает вектор более высокого качества - дополнительные экстракции и переосаждения на пользу DNA не идут.
  • п. 33.

  • Очистка от рестриктазы.
  • п. 38.

  • Mg+ требуется для нормального отжига.
  • п. 39, 40.

  • Отжиг плеч фага лямбда. На концах лямбда имеются 12-членные одноцепочечные комплементарные участки. Во время отжига эти участки слипаются, соединяя левые и правые плечи.
  • п. 41.

  • Дефосфорилирование. Если вы действительно хотите получить вектор высокого качества, фосфатазу неплохо было бы откалибровать:
    1. дефосфорилировать различным количеством CIAP ~0.2 µg векторной DNA линеаризованной той же рестриктазой, что и лямбда-вектор;
    2. переосадить;
    3. для каждого образца поставить два лигирования:
      1. на себя,
      2. с 3х кратным избытком недефосфорилированной плазмиды (лучше другого размера);
    4. прогнать результаты лигирования на форезе. Оптимальная концентрация CIAP должна предотвращать лигирование на себя, но не ингибировать лигирование с 3х кратным избытком недефосфорилированной плазмиды.

    п. 45.

  • Очистка от CIAP.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100