Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Одноцепочечные фаги > Выделение ДНК.

Выделение одноцепочечной ДНК.

По сравнению с векторами на основе М13 фагемиды имеют два достоинства:
(i) существенно меньшие ограничения на размер клонируемого фрагмента (до 10kb);
(ii) для получения одноцепочечной DNA из фагемид не требуется дополнительного клонирования;
и два недостатка:
(i) выход одноцепочечной DNA раз в 10-100 меньше, чем для М13;
(ii) часто выход неустойчив.

Выделение одноцепочечной ДНК.

  1. проверить, что используемый штамм содержит F'-фактор. Проверить, не несёт ли штамм или вектор ген устойчивости к канамицину (если несёт - использовать только R408 фаг-хелпер).
  2. перенести в 2.5ml 2xYT/Amp/Ph.helper (17ml пробирка):
    1. с чашки - колонию петлёй,
    2. из ночной культуры - 2µl;
  3. только для VCSM13:
  4. качать 200-300rpm, 37oС, 1-2h с хорошим аэрированием; добавить канамицин до 70µg/ml;

  5. качать 200-300rpm, 37oС, 16-24h с хорошим аэрированием;
  6. 2ml культуры -> в 2ml пробирку;
  7. ЦФ NT, 5-10';
  8. 1.7ml супернатанта -> в 2ml пробирку с 275µl PEG/NaCl (финальное соотношение 162 µl/ml);
  9. 0oС 15';
  10. ЦФ NT, 5';
  11. сбросить супернатант;
  12. ресуспензировать осадок в 400µl AcONa/EDTA;
  13. экстрагировать Ф:Х, Х;
  14. + 1ml EtOH, осадить;
  15. промыть 70% EtOH;
  16. растворить в 6µl H2O;
  17. определить концентрацию на форезе.
  18. Взаимная гибридизация.

    Позволяет быстро определить, действительно ли ориентации двух клонированных фрагментов противоположна.

  19. смешать
  20. ssDNA №1 => ~0.1µg
    ssDNA №2 => ~0.1µg
    NaCl 5M => 0.6µl/до 150mM
    H2O => до 20µl;

  21. 65oС, 1h;
  22. добавить буфер внесения, форез (в качестве контролей ssDNA №1 или ssDNA №2);
  23. если ориентация противоположная, то появляются гибриды с меньшей электрофоретической подвижностью.

    Растворы.

    PEG/NaCl

    p=1.145g/ml (хранить +4oС):

    Конц.Сток10ml25ml50ml300ml
    NaCl2.5M5M5ml12.5ml25ml150ml
    PEG20%тв.2g5g10g60g
    H20 mQ3.52ml8.80ml17.60ml105.62ml
    Конц.Сток10ml25ml50ml300ml
    NaCl2.5M5M5ml12.5ml25ml150ml
    PEG20%40%5ml12.5ml25ml150ml

    AcONa/EDTA

    PH 5-7, особой роли не играет (хранить +4oС):

    Конц.Сток10ml25ml50ml300ml
    AcNa0.3M3M1ml2.5ml5.0ml30.0ml
    EDTA1mM0.5M20µl50µl0.1ml0.6ml
    H20 mQ8.98ml22.45ml44.9ml269.4ml

    2xYT/Amp/Ph.helper

    2xYT
    Ampicillin 50µg/ml
    VCSM13 (или R408) 107-8pfu/ml.



    Комментарии.

    Общие.

    выбор бактериального штамма

  • Так как заражение бактерии одноцепочечным фагом происходит через F'-пили, необходимо, чтобы используемый штамм содержал f'-фактор.
  • Бактерии могут терять f'-фактор, поэтому в лабораторных штаммах в нём размещены гены, обеспечивающие возможность положительной селекции F'(+)-бактерий. В "старых" штаммах для этого используются гены, отвечающие за производство аминокислот (селекция на минимальной среде). В "современных" штаммах используются гены устойчивости к антибиотикам. Селекция на среде с антибиотиком гораздо удобнее, но требует определённой внимательности.
    1. если штамм устойчив к канамицину (XL-2Blue) его нельзя использовать в описанной выше методике с фагом-хелпером VCSM13, так как селекция на VCSM13 заражение не будет работать;
    2. удобство селекции F'(+)-бактерий вызывает соблазн добавлять антибиотик во все ростовые среды (хотя вполне достаточно проводить селекцию только перед приготовлением компетентных клеток). Иногда это приводит к плачевным результатам. Наш опыт показывает, что добавление тетрациклина мешает выделению одноцепочечной (резко снижается выход) и плазмидной DNA (бактерии начинают слипаться, плохо суспензируются в растворе "I", легко разрушаются => снижаются выход и качество). Возможно, что подобными побочными эффектами обладают и другие антибиотики.
  • Если требуется постоянно получать ssDNA, то удобно иметь компетентные клетки уже зараженные фагом-хелпером. Коротко, процедура выглядит следующим образом:
    1. заразить небольшое количество клеток VCSM13;
    2. высеять штрихом на чашку с LB/канамицин;
    3. далее - как при приготовлении обычных компетентных клеток за исключением того, что культура выращивается в SOB/канамицин.
  • Приятная черта одноцепочечных бактериофагов: их оболочка линейная, ее размер определяется размером пакуемой DNA. Теоретически этот размер может быть любым, практически, с фагемидами >15 kb могут быть проблемы.
  • Сравнение фагемид с векторами на основе М13:
    1. вставка в векторах на основе М13 часто нестабильна,
    2. фагемиды имеют существенно меньшие ограничения на размер клонируемого фрагмента (до 10kb),
    3. для получения одноцепочечной DNA из фагемид не требуется клонирования;
    4. у фагемид выход одноцепочечной DNA раз в 10-100 меньше, чем для М13,
    5. у фагемид часто выход неустойчив.
  • Непроверенная информация Альтернативный протокол выделения ssDNA:
  • * "нормальный протокол" вплоть до осаждения PEG;
    * ресуспензировать в 50 µl TE,
        либо 1х экстракция нейтральным фенолом,
        либо добавить равный объём формамида, 15' 55oС,
    * очистка на Glass milk.

    По пунктам.

    п. 1.

  • Фагемида содержит участки начала и конца репликации одноцепочечного фага М13. Для аппарата репликации одноцепочечных фагов, который экспрессирует фаг-помощник, этих участков достаточно, чтобы сделать одноцепочечную копию с плазмиды, упаковать ее и вывести из бактериальной клетки.
  • Фаг-хелпер - производная одноцепочечного фага М13, которая имеет небольшие проблемы с собственной репликацией (отчасти связанные просто с большим размером). VCSM13, кроме того, имеет ген устойчивости к канамицину, который можно использовать для положительной селекции зараженных бактерий.
  • п. 3.

  • Селекция против незараженных бактерий. Одноцепочечные фаги семейства М13 (в отличие от лямбда фага) не лизируют зараженные ими бактерии. Они реплицируются, упаковываются и выходят из бактерии не мешая ей жить и делиться. Однако, метаболическая нагрузка на бактериальную клетку так велика, что если какая-то бактерия умудрится избежать заражения, то она легко обгонит в росте зараженных.
  • п. 6.

  • Бактериальные клетки - в осадке, фагемиды - в растворе.
  • п. 7.

  • Осаждение бактериофага PEG/NaCl.
  • п. 8.

  • На этом этапе можно прерваться (+4oC, ON).
  • п. 12.

  • Очистка DNA бактериофага от компонентов белковой оболочки с помощью фенола.
  • п. 13.

  • На этом этапе можно прерваться (+4; -20oC, несколько суток).

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100