Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Одноцепочечные фаги > Выращивание и хранение хелперных фагов.

Амплификация и хранение хелперных фагов.


Амплификация.

  1. колонию XL-1Blue ( XL-1Blue MRF') c чашки LB/Tetracycline поместить в 3ml 2xYT;
  2. 200-300rpm, 30oС, ON;
  3. приготовить смесь:
  4. 3ml 2xYT:
    10µl культуры клеток,
    5µl стокового раствора фага-хелпера;

  5. 200-300rpm, 37oC, ON;
  6. только для VCSM13:
    после 30', 37oC добавить канамицин до 25µg/ml (0.5 µl/ml для 50mg/ml стока);

  7. разаликвотить по 1.2ml в 1.7ml пробирки;
  8. нагреть до 65oC, 15';
  9. ЦФ NT, 5';
  10. перенести по 1.0ml в 1.7ml пробирки с 70µl DMSO, смешать пипетированием;
  11. хранить при:
  12. +4oC => ~2 месяца,
    -80oC => неограниченное время;

    Рост из отдельной бляшки.

  13. растить бактериальную культуру до среднелогарифмической фазы;
  14. приготовить серийные разведения фага;
  15. смешать 10µl бактериальной культуры c 10µl раствора фага из п.11;
  16. смесь из п.13 перенести в 200µl верхнего 2хYT агара (47oС), смешать пипетированием, нанести "каплю" на чашку с нижним 2хYT агаром (на одной чашке можно уместить >10 разведений);
  17. перенести бляшку в 3ml 2хYT (только для VCSM13 - с канамицином (70µg/ml)), далее аналогично п.п. 4-9 амплификации.
  18. Определение титра.

  19. - (общий способ) клетки заражаются вирусом и высеваются на 2xYT-агар. Титр определяется по числу фаговых бляшек.
  20. - (только для VCSM13) клетки заражаются вирусом и высеваются на 2xYT-агар с канамицином 25µg/ml. По числу колоний определяется титр.


    Комментарии

    Общие.

  • Должно получиться:
  • ExAssist -> 7.5х108- 1.0х109pfu/ µl,
    VCSM13 -> 1.0х108- 1.0х109pfu/ µl.

    По пунктам.

    п. 2.

  • Можно растить и при 37oС, но при этом нужно следить, чтобы клетки не переросли.
  • п. 4.

  • VCSM13 несет ген устойчивости к канамицину. Это позволяет проводить селекцию против незараженных клеток.
  • п. 6.

  • Нагрев убивает бактерии.
  • п. 7.

  • Бактерии уходят в осадок, фаг остается в растворе.
  • п. 8.

  • DMSO позволяет хранить биологические объекты замороженными.
  • п. 10.

  • Бляшки одноцепочечных фагов мутные, т.к. они не убивают клетки, а лишь замедляют их рост.
  • п. 13.

  • Фаг можно нанести штрихом на нижний агар, а потом залить верхний с клетками одним движением от низких концентраций к высоким.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100