Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Плазмиды > Экспресс-метод.

Экспресс-метод выделения pDNA.

Очень удобный и быстрый метод, когда требуется быстро проанализировать наличие вставки в векторе, размер плазмиды и т.п.

  1. растить ночную культуру 16-24 часа в богатой среде: 37oС, 200-300rpm;
  2. 0.2ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку;
  3. ЦФ 30'', удалить супер;
  4. ресуспензировать осадок в 40µl 1х TE (или TAE), вортекс 5'';
  5. добавить:

    40µl Ф:Х,
    4µl 10х SDS(+)-буфера для внесения;

  6. вортекс 20'';
  7. ЦФ 5';
  8. 15-20µl водной фазы на форез.


    Комментарии.

    Общие.

  • На форезе видны геномная DNA, pDNA, рибосомная RNA и tRNA. Если размер pDNA < 3.5-4kbp она идёт слишком близко к рибосомной RNA и для аккуратного определения размера требуется включить в п.4 обработку RNase .
  • Легкое неудобство, связанное с методом : раствор в п.8 весьма вязкий и имеет склонность выскальзывать из лунки на поверхность форезного буфера при неаккуратном нанесении (важно, чтобы над гелем было ~2-3mm буфера, иначе, как ни наноси - всё равно выскользнет).
  • Если плазмида со строгим контролем (низкокопийная) нужно быть готовым к тому, что видно ее будет очень плохо.
  • По пунктам.

    п. 1

  • Дополнение: для выкалывания бактериальных колоний и старта минипрепов можно выкалывать колонии 200µl типами и отстреливать их сразу в пробирки со средой - экономит время и стерильно (меньше возни, чем с зубочистками).
    Александр Чубыкин.
  • Бактерии можно выращивать в 2ml или 1.7ml эппендорфах.
  • п. 4

  • Если требуется избавиться от RNA, п.4 =>
  • 4а. ресуспензировать осадок в 40µl TE+RNase(50µg/ml), вортекс 5'';
    4b. NT, 5-10';

    п.5.

  • Лизис бактерий, белки уходят в органическую фазу, в водной остаются нуклеиновые кислоты.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100