Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Плазмиды > Максипреп - лизис щелочью.

Выделение pDNA (максипреп - лизис щелочью).

 
Лучший метод для получения pDNA высокого качества (годится даже для трансфекции). Его преимущества:
- очень низкая цена,
- высокая скорость.

  1. растить ночную культуру 20-24 часа в 100-500ml богатой среды: 37oС, 200-300rpm;
  2. ЦФ 4oС, 10-15', слить среду;
  3. ЦФ 4krpm, 1', отсосать остатки жидкости;
  4. ресуспензировать в 10(5)ml раствора "I";
  5. + 1(0.5)ml свежеприготовленного раствора лизоцима (10mg/ml в р-ре "I");
  6. NT, 15';
  7. + 20(10)ml раствора "II", вылить резко, смешать:
  8. Конечн. Сток: 10ml 20ml
    NaOH 0.2N 1N
    10N
    2ml
    0.2ml
    4ml
    0.4ml

    SDS 1% 10% 1ml 2ml
    H2O   mQ 7ml
    8.8ml
    14ml
    17.6ml

  9. 0oС, 5';
  10. + 10(5)ml холодного 10М AcONH4 (добавлять 5 ml пипеткой по каплям), смешать;
  11. 0oС, 5';
  12. ЦФ 5krpm, 4oС, 10';
  13. супер снять, разделить на 2 пробирки, добавить к каждой по 12.5 ml изопропанола. Делать это на весах, чтобы пробирки имели равный вес;
  14. NT, 10';
  15. ЦФ 5krpm, 4oС, 10', сбросить супер;
  16. ЦФ NT, 3', отсосать остатки жидкости (не подсушивать);
  17. cуспендировать осадок в 800µl 2 M AcONH4, объединить в одной 2ml пробирке;
  18. NT, 5';
  19. ЦФ NT, 10';
  20. cупер перенести в пробирку с 800µl изопропанола;
  21. NT, 5';
  22. ЦФ NT, 5';
  23. сполоснуть 70% EtOH;
  24. растворить в 0.2-1ml H20.

  25. Комментарии.

    Смотри комментарии к 04_01 Выделение pDNA (минипреп).


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100