Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Плазмиды > Минипреп - лизис щелочью.

Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью).

Лучший метод для получения pDNA высокого качества (годится даже для трансфекции). Его преимущества:
- очень низкая цена,
- высокая скорость (сравнима только с Qiaprep spin).

  1. растить ночную культуру 16-24 часа в богатой среде: 37oС, 200-300rpm;
  2. 1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку, ЦФ 30'', удалить супер;
  3. п.2. - ещё 2 раза;
  4. ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды;
  5. ресуспензировать осадок в 200µl раствора "I", вортекс 5'';
  6. NT, 5';
  7. + 400µl раствора "II", резко вылить, сразу же резко встряхнуть, перевернуть ~5 раз;
  8. 0oС , 5' (не больше!!!);
  9. + 200µl холодного 10М AcONH4, ~5 раз перевернуть;
  10. 0oС, 5';
  11. ЦФ NT, 5';
  12. супер перенести в пробирку с 500µl изопропанола, смешать;
  13. NT, 10';
  14. ЦФ NT, 10', сбросить супер;
  15. ЦФ NT, 0.5-1', сбросить остатки изопропанола (не подсушивать);
  16. + 100µl 2М AcONH4, вортекс 20'';
  17. NT, 5';
  18. ЦФ NT, 5', перенести супер в пробирку со 100µl изопропанола;
  19. NT, 10';
  20. ЦФ NT, 10';
  21. сполоснуть осадок 70% EtOH (~200µl), подсушить.
  22. не обязательно:

    21a. + 75µl "ТЕ + RNaseA";
    21b. 37oC, 15';
    21c. + 25µl 10М AcONH4, + 100µl изопропанола;
    21d. NT, 10';
    21e. ЦФ NT, 10';

  23. растворить в 25µl (H20 или TE).

    Растворы.

    I плазмидный раствор

    для N пробирок V=0.2хN [ml] (хранить при +4oС)

    Конц.Сток50ml100ml150ml200ml
    Глюкоза50mM2M 1.25ml
    1.41g
    2.5ml
    2.825g
    3.75ml
    4.24g
    5.0ml
    5.56g

    Tris Cl, pH 8.025mM1.0 M1.25ml2.5ml3.75ml5.0ml
    EDTA10mM0.5 M1.0ml2.0ml3.0ml4.0ml
    H2O mQ46.5ml93ml139.5ml186ml

    optional: перед использованием добавить лизоцим до 5 mg/ml
    для N пробирок m(лизоцима)=N[mg]

    II плазмидный раствор

    (готовить перед использованием или хранить при NT в плотно закрытой пластиковой посуде)

    Конц.Сток0.5ml1ml2.5ml5.0ml6.5ml8.5ml11ml
    NaOH0.2N1N0.1ml0.2ml0.5ml1.0ml1.3ml1.7ml2.2ml
    SDS1%10%0.05ml0.1ml0.25ml0.5ml0.65ml0.85ml1.1ml
    H2O mQ0.350ml0.7ml1.75ml3.5ml4.55ml5. 95ml7.7ml
    Число пробирок:12612162026

    для N пробирок V=0.4хN [ml]

    TE+RNaseA

    TE + RNase A 50µg/ml (стоковый раствор 10µg/µl: 5µl на 1ml TE)



    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: Lee SY, Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA. Biotechniques. 1990 Dec; 9(6):676-9.
  • в случае большого количества плазмид работу можно значительно ускорить, подготовив заранее 3 набора подписанных пробирок:
  • 1.7-2.0ml пустые (для п. 2),
    1.7ml с 0.5ml изопропанола (для п. 12),
    0.5ml с 0.1ml изопропанола (для п.18).

  • Ограничение: метод "не любит" плазмиды со строгим контролем (низкокопийные). Сильно снижается выход и качество. В этом случае начиная с п.11 лучше пользоваться фенольной очисткой. Низкокопийные плазмиды в настоящее время чаще всего встречаются в двух "экологических нишах": старые генно-инженерные конструкции в векторе pBR322 и вектора (конструкции) для экспрессии белков.
  • "II плазмидный раствор" Во многих протоколах подчеркивается, что этот реактив должен быть свежеприготовленным. Это не обязательно. Важно только, что бы в процессе хранения CO2 из воздуха не нейтрализовал NaOH => посудина должна быть с плотно завинчивающейся крышкой, и лучше пластиковой (стекло растворяется в щелочи).
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Дополнение: для выкалывания бактериальных колоний и старта минипрепов можно выкалывать колонии 200µl типами и отстреливать их сразу в пробирки со средой - экономит время и стерильно (меньше возни, чем с зубочистками).
    Александр Чубыкин.
  • п. 6.

  • Это время необходимо для работы лизоцима. Если лизоцим не добавлен, можно сразу переходить к п.7.
  • п. 7.

  • Лизис бактерий и щелочная денатурация DNA. Нужно постараться как можно меньше раздробить геномную DNA на этом этапе, иначе возникнут проблемы с ее осаждением в п.11.
  • Требования, предъявляемые в п.7, противоречивы. Для того, чтобы получить полный лизис, требуется хорошо смешать бактериальную суспензию с раствором "II", однако, интенсивное смешивание грозит дроблением геномной DNA. Мы поступаем следующим образом:
  • 7.1.    непосредственно перед внесением (<1') раствора "II" вновь взболтать суспензию бактерий: вортекс - 2-4'';
    7.2.    не касаясь пробирки типом быстро внести 400µl раствора "II"; сразу же закрыть пробирку; резко встряхнуть 2-3 раза. Для того, чтобы прошел лизис требуется ~2''. надо уложиться со встряхиванием в это время;
    7.3.    через ~1' медленно перевернуть пробирку 2-3 раза.

    п. 8.

  • Превышение времени денатурации чревато тем, что плазмида денатурирует необратимо - одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурированные плазмиды вполне годятся для сиквенса, но не режутся рестриктазами и обладают аномальной подвижностью на электрофорезе.
  • Необратимо денатурированная плазмида

    п. 9.

  • Нейтрализация раствора.
  • Геномная DNA случайно регибридизуется образуя большие сети, кольцевая pDNA благополучно ренатурирует. Белки с SDS агрегируют при высокой концентрации соли (на холоду это получается лучше).
  • Важно, чтобы нейтрализация была полной и не осталось областей с вязким раствором. Нужно смешивать раствор вначале мягко, чтобы не дробить геномную DNA, но после того как она уже ассоциирует (через ~1'), ничто не мешает встряхнуть посильнее. Однако, всё же не на вортексе.
  • п. 10.

  • Можно прерваться (+4oC, несколько суток).
  • п. 12.

  • В этой методике можно прерваться при любом осаждении нуклеиновых кислот после добавления спирта (-20oC, любое время).
  • п. 15.

  • В этом месте важно работать быстро и аккуратно, так как pDNA будет плохо растворяться если оставить много изопропанола или пересушить осадок.
  • п. 16.

  • Устранение большей части рибосомной RNA. В высокой соли одноцепочечная RNA образует большие ассоциаты (может быть за счет случайной гибридизации) и не растворяется. Однако tRNA (видимо, из-за легкости образования внутримолекулярных двухцепочечных участков) сравнительно легко растворяется в высокой соли. Если требуется устранить и её, нужно выполнить п.п. 21a-e.
  • В этом месте важно работать быстро и аккуратно, так как pDNA будет плохо растворяться если оставить много изопропанола или пересушить осадок.
  • п. 21.

  • Отмывка от изопропанола.
  • п. 21a-e.

  • Расщепление tRNA и остатков рибосомной RNA.
  • Важно, иметь в виду, что рибонуклеотидтрифосфаты, образующиеся после расщепления RNase вполне способны выпасть в осадок вместе с плазмидной DNA и выдержать споласкивание 70% EtOH. => измерять концентрацию pDNA с помощью спектрофотометра дело опасное даже после обработки RNase.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100