Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с бактериями > Гибридизация бактериальных колоний.

Гибридизация бактериальных колоний с радиоактивным зондом.

Удобный метод при анализе большого (100-1000) количества клонов на наличие интересующей последовательности в плазмиде.

  1. Вырезать нитроцеллюлозный фильтр по шаблону. Отметить карандашом положение будущих колоний. Пометить правый верхний угол. Для этого фильтра подготовить стерильную чашку Петри (чашка "1");
  2. С внутренней стороны другой чашки Петри отметить маркером по этому-же шаблону положение будущих колоний. Отметить правый верхний угол (чашка "2"), обработать UV 30';
  3. Залить чашку "1", "2" с агаром и антибиотиком. Залить чашку с агаром для остужения платиновой петли;
  4. На чашку "1" положить без пузырей влажный фильтр, обработать UV 10';
  5. Каждую анализируемую колонию переколоть в одну и ту же позицию на чашку "1" и "2". Растить при 37оС до размера 1-2 мм ( 12-16h);
  6. Чашку "2" убрать в холодильник, с чашки "1" снять пинцетом фильтр;
  7. Обработать фильтр 0.5 М NaOH 7';
  8. Обработать фильтр нейтрализующим раствором 2 раза по 3';
  9. Сполоснуть фильтр 2xSSC, 5';
  10. Подсушить фильтр под лампой 10';
  11. Гибридизовать с зондом в растворе Denchardt при 60оС, 12-24h;
  12. Отмыть фильтр, заложить на экспозицию
  13. Проявленный автограф совместить с фильтром и определить положение гибридизующихся клонов;
  14. Прогибридизовавшиеся клоны взять для дальнейшей работы с чашки "2".
Автограф.Шаблон.
 Так выглядит автограф после гибридизации. Яркие сигналы - это гибридизующиеся колонии(1), слабые сигналы - это фоновая гибридизация(2), отсутствие сигнала - колонии в этих позициях не выросли (3). Мы используем такой шаблон для обычных чашек диаметром 9 см. 

    Растворы.

    Нейтрализующий раствор

    Конц.Сток100ml
    NaCl1.5M58.44g/M8.77g
    Tris Cl pH 7.51M1Mдо 100mlдо 

    2xSSC

    Конц.Сток100ml
    SSC2x20x10ml
    H2O mQдо 100mlдо 

    Раствор Denchardt

    (хранить при +4oС)
    Конц.Сток50ml300ml1L
    SSC2x20x5ml30ml100ml
    Ficoll 4000.2%(w/v)тв.0.1g0.6g2g
    Polyvinilpyrolidone0.2%(w/v)тв.0.1g0.6g2g
    BSA0.2%(w/v)тв.0.1g0.6g2g
    SDS0.2%(w/v)тв.0.1g0.6g2g
    H2O mQдо 50mlдо 300mlдо 1Lдо 


    Комментарии.

    Общие.

  • В основном этот метод имеет смысл применять, когда есть необходимость проверить большое количество клонов на наличие вставки в плазмиде (например, при низкой эффективности клонирования или при одновременном клонировании большого количества фрагментов). При умеренном количестве клонов проще проверить наличие вставки с помощью PCR. Так же этот способ удобен, если отсутствуют другие возможности для проверки: отсутствует сине-белый тест, нет возможности для проверки с помощью PCR-реакции, и.т.д.
  • Скорость перекалывания примерно 150 колоний в час. За день можно переколоть около 1000 колоний, если постараться.
  • По пунктам.

    п.1.

  • Количество фильтров определяется количеством колоний необходимых для перекола.
  • Имеет смысл перекалывать колонии рядами, чтобы потом легко можно было локализовать положение гибридизующихся колоний.
  • п.3.

  • Для чашки "1" можно увеличить количество антибиотика. Мы используем концентрацию ампициллина 100 и 50 mkg/ml для чашки "1" и "2" соответственно.
  • п.4.

  • Фильтр должен быть не мокрым, а влажным. Для этого фильтр смочить в воде и промокнуть фильтровалкой. Двумя пинцетами наложить фильтр на чашку.
  • п.5.

  • Анализируемые колонии - это чаще всего клоны после трансформации лигазной смеси.
  • Мы перекалываем так: нагреваем на газу до красна платиновую петлю, несколько секунд охлаждаем на воздухе, охлаждаем в агаре, берем петлей колонию, перекалываем на фильтр, перекалываем на чашку. Для следующей колонии - та же процедура.
  • Важно, чтобы колонии не перерастали. Если колонии перерастают, то это ведет к увеличению фона гибридизации. Также желательно перекалывать на фильтр свежие колонии. Они растут равномернее и дают небольшой фон.
  • п.7.

  • Критерий нормальной денатурации колоний - колонии должны стать блестящими.
  • п.7,8.

  • Обработку фильтра с колониями проводить следующим образом: в чашку Петри налить 1-1.5ml раствора и положить на его поверхность фильтр колониями вверх, так чтобы раствор равномерно распределился между чашкой и фильтром. Не допускать попадания растворов на верхнюю поверхность с колониями ( особенно NaOH), иначе это приведет к тому, что колонии расползутся по фильтру. Перед обработкой следующим расвором фильтр промакивать фильтровалкой, не касаясь поверхности с колониями.
  • п.10.

  • Фильтр должен подсохнуть очень хорошо.
  • п.11.

  • В качестве зонда обычно берется клонируемый фрагмент. При одновременном клонировании большого количества фрагментов можно использовать смесь зондов или гибридизовать в разных стаканах.
  • Скорее всего гибридизацию можно вести и в других буферах, типа HSB, но мы не проверяли.
  • п.12.

  • При закладке на экспозицию скрепить скотчем пленку и фильтр в нескольких местах.
  • п.13.

  • Перед проявкой проколоть и фильтр и пленку в трех местах, потом по проколам совместить. Обычно негибридизующиеся колонии дают небольшой фон и поэтому легко определить координаты положительного сигнала.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100