Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с бактериями > Долговременное хранение.

Хранение бактериальных штаммов.

На наш взгляд, долговременное хранение оправдано для (i) коллекционных культур и для (ii) штаммов-продуцентов. Для последних, кроме коллекционных пробирок имеет смысл готовить серьёзные аликвоты для выращивания (часто эти штаммы нестабильны и приготовить сток аликвот значительно проще, чем каждый раз контролировать эффективность экспрессии).

    На -70oС (неограниченное время).

    Приготовление стока.

  1. вырастить ночную культуру (можно с антибиотиком);
  2. 5-15% глицерин:
  3. перенести 850µl культуры в пробирку с 75-150µl глицерина;

    7% DMSO:

    перенести 930µl культуры в пробирку с 70µl DMSO;

  4. смешать, заморозить в жидком азоте;
  5. хранить на -70oС неограниченное время.
  6. Высев клеток штрихом

    Высев клеток из -70oС стока.

    NB!!!Во время высева пробирка с клетками должна постоянно находиться в жидком азоте.

  7. раскалить петлю на пламени горелки;
  8. воткнуть в культуру, дать ей вмёрзнуть;
  9. выдернуть петлю из пробирки вместе с несколькими микролитрами намёрзшей культуры;
  10. перенести на чашку, размазать в небольшое пятнышко;
  11. простерилизовать петлю, сделать серию параллельных штрихов;
  12. сделать ещё несколько серий параллельных штрихов (см. Рис.), стерилизуя петлю между сериями.
  13. В анаэробных условиях в столбиках (до года).

    Приготовление стока.

  14. разлить по ~1.2ml агара (без антибиотиков) в 2ml пробирки с завинчивающимися крышками;
  15. снять петлёй бактериальную колонию (или обмакнуть петлю в ночную культуру);
  16. 2-3 раза воткнуть петлю в столбик;
  17. плотно завинтить крышку, хранить в темноте при NT.
  18. Высев клеток из столбика.

  19. воткнуть стерильную петлю непосредственно в культуру столбика;
  20. перенести на чашку, размазать в небольшое пятнышко;
  21. простерилизовать петлю, сделать серию параллельных штрихов;
  22. сделать ещё несколько серий параллельных штрихов (см. Рис.), стерилизуя петлю между сериями.


    Комментарии.

    Общие.

  • Новый "фирменный" штамм используется (без размораживания) только для создания -70oС стока: высеять штрихом, поставить 5 ночных культур (3 - из различных индивидуальных колоний, 2 - из массы колоний), далее начиная с "п.2.".
  • Хранение в столбиках имеет смысл использовать только для транспортировки клеток при комнатной температуре.
  • Весьма распространенно беспокойство по поводу качества DMSO, длительное время хранившегося при NT. Мы убеждены, что, если речь идет о хранении замороженных бактериальных клеток, то беспокоится не о чем.
  • По пунктам.

    п. 2.

  • Глицерин и DMSO предотвращают образование больших кристаллов воды, которые разрушают бактериальные клетки.
  • Нам больше нравится метод, использующий DMSO, т.к.
  • (i) его (DMSO) нет нужды стерилизовать,
    (ii) глицерин вязкий, фасовать приходится на весах.

  • Очень хорошая альтернатива в случае большого количества пробирок - добавлять к 500µl культуры 500µl среды с 30% глицерином.
  • Можно разаликвотить глицерин (или DMSO) заранее и хранить при NT (+4oС), соответственно.
  • п. 5.

  • Нам больше нравится, когда петля платиновая.
  • Мы стерилизуем петлю следующим образом:
    1. стерилизация:

    2. раскалить петлю до красна на пламени горелки;
    3. охлаждение:

    4. погрузить проволочку (но не её держатель) в спирт;
    5. быстро провести над горелкой (что бы спирт загорелся);
    6. охладить на воздухе ~2'. Если охлаждалось меньшее время, можно перед тем, как забрать колонию прижать петлю на 3-5'' к свободному от бактерий участку агара на чашке (смысл процедуры в том, что на воздухе раскаленная до красна петля остывает довольно долго. В спирте - быстрее. Конечно, при сгорании спирта она нагревается вновь, но уже не так сильно).

    пп. 9, 10

  • Удобнее стерилизовать две петли, и работать одной пока вторая остывает после стерилизации.
  • Штриховка - чтобы разбавить плотную смесь до отдельных клеток.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100