Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Двугибридная система > ПЦР дрожжевых колоний.

ПЦР дрожжевых колоний.

Быстрый протокол для лизиса дрожжевых колоний перед ПЦР.


  1. Суспендировать колонию в 25µl лизирующего буфера;
  2. Инкубировать 1.5-3.5h при 37oC на шейкере;
  3. Добавить 25µl стеклянных шариков, вортекс 5';
  4. Добавить 100µl воды, перемешать;
  5. На ПЦР взять 1µl.

    Растворы.

    Лизирующий буфер

    Конц.Сток1ml5ml10ml
    Tris/EDTA1x1x1ml5ml10ml
    b-MeEtOH0.3%100%3µl15µl30µl
    b-glucuronidase2%100%20µl100µl200µl
     Готовить непосредственно перед использованием.

    "Tris/EDTA"

    Конц.Сток50ml100ml200ml
    Tris Cl, pH 7.650mM1M0.5ml1ml2ml
    EDTA10mM0.5 M100µl200µl400µl
    H2O mQ33.4ml66.8ml133.6ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Для уменьшения временных затрат в двугибридном скрининге, полезно элиминировать повторяющиеся клоны еще на этапе дрожжевых колоний. Это удобно сделать с помощью ПЦР и последующей гибридизации.
  • Cтеклянные шарики - Sigma #G-8772.
  • b-glucuronidase from Helix pomatia (Type HP-2). Sigma, G-7017.
  • По пунктам.

    п. 3.

  • Этот пункт можно опустить, если одновременно анализируется много образцов. Улучшение незначительное, а трудоемкость возрастает существенно.
  • п. 5.

  • Возможно, что для ПЦР понадобится достаточно большое количество циклов (35-40). Время элонгации можно поставить 1 минуту. Нормально получаются фрагменты от 500 до 2500bp.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100