Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Двугибридная система > Поиск автоактиваторов.

Поиск автоактиваторов в двугибридной системе.

Автоактиваторы - белки, способные активировать репортерные гены LacZ и His3 без взаимодействия с белком партнером. Такие клоны следует исключить из дальнейшей работы.

  1. Залить три чашки:
       SD-leu+Canavanine или SD-leu+Cycloheximid,
       SD-leu-trp,
       SD-leu-trp-his.
  2. Маркером отметить положение будущих колоний по единому шаблону;
  3. Каждую анализируемую колонию суспендировать в 15µl 1xTE в 0.5ml пробирке или микроплашке;
  4. Нанести семплером по 5µl суспендированных клеток на все три чашки в одну и ту же позицию;
  5. Подрастить колонии (примерно 2-3 дня);
  6. Проверить активацию репортерного гена LacZ в дрожжах на всех трех чашках, используя этот протокол;
  7. Для дальнейшей работы использовать те колонии, которые выросли на всех трех чашках, посинели на чашках SD-leu-trp, SD-leu-trp-his, но не посинели на чашке с антибиотиком

    Растворы.

    "Canavanine"

     Сток (4000x):20mg/ml
     Рабочая концентрация:5µg/ml

    "Cycloheximide"

     Сток:1mg/ml
     Рабочая концентрация:1µg/ml


    Рабочие концентрации антибиотиков варьируются в зависимости от линии дрожжей. Например для линии CG1945 необходима концентрация циклогексимида 1µg/ml, а для Y190 10µg/ml.



    Комментарии.

    Общие.

  • Автоактиваторы - это белки, способные активировать репортерные гены LacZ и His3 без взаимодействия с белком партнером. Например если некоторый белок X содержит домен, способный выполнять функцию активирующего домена (AD), то слитный белок состоящий из домена связывания (BD) и белка X, может активировать репортерные гены LacZ и His3.
  • В результате двугибридного скрининга отбираются клоны положительные по активации двух репортерных генов LacZ и His3. Эти клоны могут быть как реальными претендентами на белки-партнеры нашего исследуемого белка, так и автоактиваторами. Каждая отобранная дрожжевая колония содержит как AD-плазмиду, так и BD-плазмиду. В BD-плазмиде клонирован исследуемый белок, AD-плазмида содержит последовательность из кДНК библиотеки. Необходимо проверить не кодирует ли эта последовательность белок, являющийся автоактиватором. Для этого исследуется способность белка из кДНК библиотеки активировать репортерные гены при отсутствии BD плазмиды с исследуемым белком.
  • Вектора для двугибридной системы содержат гены чуствительности к антибиотикам: либо к канаванину, либо к циклогексимиду. Дрожжи трансформированные такой плазмидой не способны расти на среде с этим антибиотиком. Допустим, что BD вектор содержит ген чуствительности к канаванину. Тогда при рассеве дрожжей на среду с канаванином вырастут только те дрожжи, у которых произошла потеря BD плазмиды. Если такие колонии будут синеть, то оставшаяся AD плазмида, кодирует белок автоактиватор. Дрожжи следует высевать на селективную среду без той аминокислоты, которая соответсвует AD вектору. В данном случае на среду без лейцина.
  • Часто в двугибридных системах AD вектор содержит ген чуствительности к одному антибиотику, а BD вектор к другому. Это удобно, так как путем рассева на тот или другой антибиотик, можно элиминировать любую плазмиду.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Следует использовать либо канаванин, либо циклогексимид в зависимости от того, какую плазмиду следует оставить.
  • п. 4.

  • Набрать 15µl и на глаз разнести на три чашки. Можно использовать репликаторы - пластинку со штырьками, соответствующими лункам плашки.
  • п. 7.

  • Колонии которые синеют на чашке с антибиотиком, содержат белок автоактиватор. Подобные колонии необходимо исключить из дальнейшей работы.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100