на главную страницу
 > Методы > Двугибридная система > Проверка взаимодействия двух белков.

Проверка взаимодействия двух белков в двугибридной системе.

Достаточно быстрый и простой метод для проверки взаимодействия двух белков.

    Проверка взаимодействия.

  1. В векторе pACT2 в правильной рамке проклонировать последовательность, кодирующую один из двух исследуемых белков ( плазмида A);
  2. В векторе pAS2-1 в правильной рамке проклонировать последовательность, кодирующую другой белок ( плазмида B);
  3. Трансформировать дрожжи одновременно плазмидой A и B, используя этот протокол;
  4. Рассеять трансформированные дрожжи на чашку со средой SD-leu-trp и SD-leu-trp-his;
  5. Если на чашке SD-leu-trp-his выросли колонии, проверить активацию гена LacZ, используя этот протокол;
  6. Контроли.

  7. Трансформировать дрожжи одновременно плазмидой A и pAS2-1, используя этот протокол;
  8. Рассеять на среду SD-leu-trp и SD-leu-trp-his;
  9. Трансформировать дрожжи одновременно плазмидой B и pACT2, используя этот протокол;
  10. Рассеять трансформированные дрожжи на среду SD-leu-trp и SD-leu-trp-his;
  11. Если на чашках SD-leu-trp-his в п.7,9 выросли колонии, проверить активацию гена LacZ, используя этот протокол;
  12. Ожидаемый результат.

  13. На чашках SD-leu-trp в п.4,7,9 должны вырасти по несколько сотен колоний;
  14. В случае реального взаимодействия двух исследуемых белков, дорожжи должны расти на чашке SD-leu-trp-his в п.4 и синеть в п.5. На контрольных чашках SD-leu-trp-his в п.7,9 не должны расти, а при незначительном росте не должны синеть.


    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 User Manual", Clontech.
  • Плазмида pACT2 кодирует домен активации (AD) транскрипционного фактора GAL4, плазмида pAS2-1 - домен связывания (BD). В данной двугибридной системе используются дрожжи дефектные по синтезу лейцина, триптофана и гистидина и не способные расти на среде без этих аминокислот.
  • Плазмида pACT2 содержит ген LEU2, плазмида pAS2-1 ген TRP1. Дрожжи трансформированные pACT2 могут расти на среде SD-leu, трансформированные pAS2-1 - на среде SD-trp, обеими плазмидами - на среде SD-leu-trp. Колонии растут на среде SD-leu-trp-his, если содержат AD и BD плазмиды, кодирующие два взаимодействующих белка, так как в этом случае происходит активация репортерного гена HIS3.
  • В случае двух взаимодействующих белков должна происходить также активация второго репортерного гена - LacZ, что можно детектировать по синей окраске колоний при добавлении X-gal.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Клонировать нужно в такой рамке считывания, чтобы образовывался слитный белок с AD доменом.
  • п. 2.

  • Клонировать нужно в такой рамке считывания, чтобы образовывался слитный белок с BD доменом.
  • п. 4.

  • На среде SD-leu-trp вырастают колонии, содержащие обе плазмиды, А и В. Этот рассев нужен для контроля трансформации. На среде SD-leu-trp-his вырастают колонии, если плазмиды A и В кодируют два взаимодействующих белка.
  • п. 5.

  • Если белки реально взаимодействуют, то колонии, выросшие на чашке SD-leu-trp-his, должны посинеть. Обычно, если колонии дрожжей хорошо растут на чашке SD-leu-trp-his (вырастают до размера более 2мм за 3-4 дня), то они и хорошо синеют ( за 0.5-1h).
  • п. 11.

  • На среде SD-leu-trp вырастают колонии, содержащие обе плазмиды. Этот рассев нужен для контроля трансформации.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100