на главную страницу
 > Методы > Двугибридная система > Трансформация дрожжей кДНК библиотекой.

Трансформация дрожжей кДНК библиотекой.

Этот метод используется для трансформации дрожжей кДНК библиотекой, в дрожжевой двугибридной системе от Clontech. Для трансформации дрожжей индивидуальной плазмидой следует использовать этот протокол..

    Трансформация BD плазмидой.

  1. Рассеять дрожжи со стока (-70oC) на YPD чашку;
  2. Растить при 30oC (примерно 1-2 дня);
  3. Трансформировать дрожжи BD плазмидой используя этот протокол;
  4. Высеять на чашку SD-trp;
  5. Растить при 30oC (примерно 3 дня);
  6. Приготовление компетентных клеток.

  7. Суспендировать десяток колоний в 1ml SD-trp среды;
  8. В колбу с 150ml SD-trp среды посеять 1ml дрожжей из п.6;
  9. Растить 16-18h при 30oC;
  10. В колбу с 1L YPD посеять ночную культуру до OD600=0.2-0.3;
  11. Растить 3h при 30oC;
  12. ЦФ в 50ml нунках 5', 4500rpm, RT;
  13. Суспендировать осадок в 500ml H2O;
  14. ЦФ 5', 4500rpm, RT;
  15. Суспендировать осадок в 8ml свежеприготовленного раствора "TE/LiAc";
  16. Трансформация кДНК библиотекой.

  17. Приготовить 100ml раствора "PEG/LiAc";
  18. Cмешать:
       кДНК библиотека в векторе AD:    500µg
       геномная ДНК:    20mg;
  19. Добавить 8ml компетентных клеток, хорошо смешать;
  20. Добавить 60ml раствора "PEG/LiAc";
  21. Бактериальная качалка, 30oC, 30';
  22. Добавить 7ml DMSO, мягко смешать;
  23. Heat shock 42oC, 15', периодически смешивать, переворачивая пробирки;
  24. Охладить клетки во льду 2';
  25. ЦФ 5', 4500rpm, RT;
  26. Суспендировать осадок в 10ml 1xTE;
  27. Высеять на три чашки SD-leu-trp аликвоты с десятикратным разведением:
      1. 500µl 1xTE + 10µl дрожжей из п.24 (1/1000 от общего объема)
      2. 500µl 1xTE + 50µl из пробирки 1
      3. 500µl 1xTE + 50µl из пробирки 2;
  28. Высеять все дрожжи из п.24 на среду SD-leu-trp-his. Использовать 5-10 чашек размером 20x20см;

    Растворы.

    YPD среда

    Конц.Сток100ml200ml1L
    Бакто-пептон2%тв.2g4g20g
    Бакто-дрож. экст.1%тв.1g2g10g
    Бакто-агар1.8%тв.1.8g3.6g18g
    Глюкоза2%40%5ml10ml50ml
    H2O mQ95ml190ml950ml
       Смешать все, кроме глюкозы. Довести pH до 5.8, автоклавировать.
       Добавить стерильную глюкозу.
       Если нужна жидкая среда, агар не добавлять.

    SD среда

    Конц.Сток100ml200ml1L
    Difco yeast nitrogen base
    w/o amino acids
    (Difco #0919-15-3)
    0.7%тв.0.7g1.4g7g
    Бакто-агар2%тв.2g4g20g
    Глюкоза2%40%5ml10ml50ml
    H2O mQ95ml190ml950ml
       Смешать все, кроме глюкозы. Довести pH до 5.8, автоклавировать.
       Добавить стерильную глюкозу и необходимые аминокислоты.
       Аминокислоты можно добавлять и перед автоклавированием.
       Если нужна жидкая среда, агар не добавлять.

    "TE/LiAc"

    Конц.Сток5ml10ml20ml
    TE1x10x0.5ml1ml2ml
    LiAc0.1M1M0.5ml1ml2ml
    H2O mQ4ml8ml16ml

    "PEG/LiAc"

    Конц.Сток10ml60ml100ml
    PEG 400040%50%8ml48ml80ml
    TE1x10x1ml6ml10ml
    LiAc0.1M1M1ml6ml10ml

    Геномная ДНК

     Clontech рекомендует использовать Herring testes carrier DNA 10mg/ml (#K1606-A).
     Мы используем лиофилизованную ДНК из спермы лосося. Лиофилизованную ДНК растворить, озвучить. При желании получить более чистую ДНК, ее можно отфенолить. Растворить в 1xTE. Довести концентрацию до 10mg/ml.


    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 User Manual", Clontech.
  • Компетентность этого метода примерно 104колоний/µg плазмиды.
  • Двугибридный скрининг используют для поиска взаимодействующих белков. Для этого последовательность, кодирующая исследуемый белок, клонируется в BD вектор в такой рамке считывания, чтобы образовывался слитный белок с BD доменом. кДНК библиотека клонируется в AD вектор. После первичного скрининга вырастают колонии дрожжей, содержащие AD плазмиду, кодирующую белок, потенциально взаимодействующий с исследуемым белком.
  • По пунктам.

    п. 2.

  • Дрожжи с чашки можно сохранить, суспендировав их в YPD среде с 20% глицерином. Хранить при -70oC.
  • п. 3.

  • В плазмиду должна быть предварительно клонирована последовательность, кодирующая исследуемый белок.
  • п. 5.

  • Дрожжи, трансформированные BD плазмидой, можно сохранить, суспендировав их в SD среде с 20% глицерином. Хранить при -70oC. Это удобно, не надо каждый раз делать трансформацию. Эти клетки можно использовать в дальнейшем для подтверждения взаимодействия тех клонов, которые будут получены после двугибридного скрининга.
  • п. 6.

  • Среда в эппендорфе должна стать заметно мутной.
  • п. 8.

  • Должны подрости до OD600>1.5.
  • п. 10.

  • Должны подрости примерно до OD600=0.5.
  • п. 11.

  • Мы осаждаем их в десяти 50ml нунках за два приемаx.
  • п. 25.

  • Рассев на чашки SD-leu-trp нужен для определения эффективности трансформации кДНК библиотеки. По количеству колоний на чашках можно расчитать, сколько бы выросло колоний, если бы мы рассеяли все дрожжи на среду SD-leu-trp. Это количество должно превышать количество независимых клонов в библиотеке. Например, мы трансформировали 500 µg библиотечной плазмиды при компетентности 104колоний/µg и получили 5000, 500, 50 колоний на трех чашках. Значит мы провели скрининг 5x106 колоний, что нормально при количестве независимых клонов в библиотеке 2x106. Если эффективность трансформации получается выше, чем 104колоний/µg, то можно трансформировать меньшее количество библиотеки. Эффективность трансформации имеет смысл определить в предварительном эксперименте, трансформировав аликвоту библиотеки и затем расчитать сколько надо взять в основной эксперимент.
  • Несколько разведений нужно для того, чтобы было удобно считать колонии. Компетентность заранее не известна, и можно при одном разведении получить слишком много или слишком мало колоний.
  • п. 26.

  • На среде SD-leu-trp-his вырастают колонии дрожжей, содержащие AD плазмиду, кодирующую белок, потенциально взаимодействующий с исследуемым белком.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100