Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Двугибридная система > Выделение pDNA из дрожжей на колонках.

Выделение плазмидной ДНК из дрожжей на колонках.

Быстрый метод выделения плазмидной ДНК из дрожжей на колонках для последующей трансформации E.coli или проведения PCR.

  1. Посеять одиночную колонию в 3ml селективной среды и растить не менее 20h при +30°С;
  2. 1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку, ЦФ 3', удалить супер;
  3. Суспендировать осадок в 300µl раствора "Tris/Сорбитол";
  4. Добавить 5 µl литиказы (10u/µl);
  5. 37°С, 1h, время от времени перемешивать;
  6. ЦФ 3', удалить супер;
  7. Суспендировать осадок в 50µl "I" плазмидного раствора;
  8. + 100µl "II" плазмидного раствора, ~3 раза перевернуть;
  9. 0oС, 5';
  10. + 50µl холодного 10М AcONH4, ~3 раза перевернуть;
  11. 0oС, 5';
  12. ЦФ 10', супер перенести в новую пробирку;
  13. К суперу добавить 800µl "Capture buffer"
  14. Поместить колонку в 2ml пробирку;
  15. Нанести на колонку 500µl из п.13, ЦФ 1';
  16. Нанести на колонку оставшиеся 500µl из п.13, ЦФ 1';
  17. Нанести на колонку 500µl "Wash buffer", ЦФ 1';
  18. Поместить колонку в чистую 1.5ml пробирку;
  19. Нанести на колонку 20-50µl 10mM Tris-HCl pH=8.0, инкубировать 2';
  20. ЦФ 20'', элюат перенести в новую пробирку.

    Растворы.

    "Tris/Сорбитол"

    Конц.Сток1ml10ml100ml
    Tris Cl, pH 8.050mM1M50µl0.5ml5ml
    Сорбитол1M2M500µl5ml50ml
    H2O mQ450µl4.5ml45ml

    "I плазмидный раствор"

    Конц.Сток50ml100ml1L
    Глюкоза50mM2M1.25ml2.5ml25ml
    Tris Cl, pH 8.025mM1M1.25ml2.5ml25ml
    EDTA10mM0.5M1.0ml2.0ml20ml
    H2O mQ46.5ml93ml930ml

    "II плазмидный раствор"

    Конц.Сток1ml10ml100ml
    NaOH0.2N1N0.2ml2ml20ml
    SDS1%10%0.1ml1ml10ml
    H2O mQ0.7ml7ml70ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Плазмидная ДНК, выделенная этим методом, не имеет особого загрязнения геномной ДНК и РНК, но концентрация ее очень мала. Тем не менее, ее вполне достаточно для химической трансформации E.coli. Если трансформировать 5µl выделенной плазмиды, то вырастает обычно около сотни колоний.
  • Плазмида также годится для проведения PCR.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Мы обычно растим дрожжи в SD среде с необходимым набором аминокислот. Если необходимо, с добавлением антибиотиков. В богатой среде YPD можно растить только те плазмиды, которые достаточно стабильны и не теряются в процессе роста дрожжей.
  • п. 4.

  • Литиказа (Sigma, #L4025) разрушает клеточную стенку дрожжей.
  • п. 13.

  • Мы используем стекловолоконные колонки фирмы Amersham (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, #27-9602-01). Можно также использовать кит фирмы Qiagen или любой аналогичный.
  • п. 14.

  • Пробирка берется такая, что бы уровень жидкости после центрифугирования в пунктах 15, 16,17 не касался нижнего края колонки. Можно использовать 2ml пробирки с завинчивающейся крышкой или пробирки из кита.
  • п. 15,16,17.

  • После каждого пункта, удалять жидкость, прошедшую через колонку.
  • п. 20.

  • Элюат - это то, что сошло с колонки.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100