Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Двугибридная система > Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.

Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.

Этот протокол используется для трансформации дрожжей плазмидной ДНК в дрожжевой двугибридной системе от Clontech.

    Приготовление компетентных клеток.

  1. Суспендировать несколько колоний дрожжей в 1ml YPD или SD среды;
  2. В колбу с 50ml YPD или SD среды посеять 1ml дрожжей из п.1;
  3. Растить 16-18h при 30oC;
  4. В колбу с 300ml YPD посеять ночную культуру до OD600=0.2-0.3;
  5. Растить 3h при 30oC;
  6. ЦФ в 50ml нунках 5', 4500rpm, RT;
  7. Суспендировать осадок в 50ml H2O;
  8. ЦФ 5', 4500rpm, RT;
  9. Суспендировать осадок в 1.5ml свежеприготовленного раствора "TE/LiAc";
  10. Трансформация.

  11. Приготовить раствор "PEG/LiAc";
  12. В эппендорфе смешать:
       плазмида BD:    0.1µg
       плазмида AD:    0.1µg
       геномная ДНК:    100µg;
  13. Добавить 100µl компетентных клеток, хорошо смешать;
  14. Добавить 600µl раствора "PEG/LiAc";
  15. Встряхивать на бактериальном шейкере 30oC, 30';
  16. Добавить 70µl DMSO, смешать;
  17. Heat shock 42oC, 15';
  18. Охладить клетки во льду 2';
  19. ЦФ 5'', 14000rpm;
  20. Суспендировать осадок в 500µl 1xTE;
  21. Высеять на чашку с селективной средой.

    Растворы.

    YPD среда

    Конц.Сток100ml200ml1L
    Бакто-пептон2%тв.2g4g20g
    Бакто-дрож. экст.1%тв.1g2g10g
    Бакто-агар1.8%тв.1.8g3.6g18g
    Глюкоза2%40%5ml10ml50ml
    H2O mQ95ml190ml950ml
       Смешать все, кроме глюкозы. Довести pH до 5.8, автоклавировать.
       Добавить стерильную глюкозу.
       Если нужна жидкая среда, агар не добавлять.

    SD среда

    Конц.Сток100ml200ml1L
    Difco yeast nitrogen base
    w/o amino acids
    (Difco #0919-15-3)
    0.7%тв.0.7g1.4g7g
    Бакто-агар2%тв.2g4g20g
    Глюкоза2%40%5ml10ml50ml
    H2O mQ95ml190ml950ml
       Смешать все, кроме глюкозы. Довести pH до 5.8, автоклавировать.
       Добавить стерильную глюкозу и необходимые аминокислоты.
       Аминокислоты можно добавлять и перед автоклавированием.
       Если нужна жидкая среда, агар не добавлять.

    "TE/LiAc"

    Конц.Сток5ml10ml20ml
    TE1x10x0.5ml1ml2ml
    LiAc0.1M1M0.5ml1ml2ml
    H2O mQ4ml8ml16ml

    "PEG/LiAc"

    Конц.Сток5ml10ml20ml
    PEG 400040%50%4ml8ml16ml
    TE1x10x0.5ml1ml2ml
    LiAc0.1M1M0.5ml1ml2ml

    Геномная ДНК

     Clontech рекомендует использовать Herring testes carrier DNA 10mg/ml (#K1606-A).
     Мы используем лиофилизованную ДНК из спермы лосося. Лиофилизованную ДНК растворить, озвучить. При желании получить более чистую ДНК, ее можно отфенолить. Растворить в 1xTE. Довести концентрацию до 10mg/ml.


    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 User Manual", Clontech.
  • Если требуется максимальная компетентность, то клетки следует использовать в течении часа после приготовления. При необходимости клетки можно использовать и через несколько часов, но их компетентность будет несколько ниже.
  • Компетентность получается примерно 104-105 колоний/µg плазмиды.
  • AD плазмида кодирует домен активации, BD плазмида - домен связывания. В двугибридной системе "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2" используются AD и BD домены дрожжевого транскрипционного фактора GAL4. Соответствующие вектора называются pACT2 и pAS2-1.
  • В качестве BD домена также часто используется бактериальный белок LexA.
  • В данной двугибридной системе используются дрожжи дефектные по синтезу лейцина, триптофана и гистидина и не способные расти на среде без этих аминокислот. Плазмида pACT2 содержит ген LEU2, плазмида pAS2-1 ген TRP1. Дрожжи трансформированные pACT2 могут расти на среде SD-leu, трансформированные pAS2-1 - на среде SD-trp, обеими плазмидами - на среде SD-leu-trp. Колонии растут на среде SD-leu-trp-his, если содержат AD и BD плазмиды, кодирующие два взаимодействующих белка, так как в этом случае происходит активация репортерного гена HIS3.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Среда в эппендорфе должна стать заметно мутной.
  • п. 1,2.

  • Для подроста дрожжей, предварительно трансформированных плазмидой, использовать селективную среду (либо SD-leu, либо SD-trp в зависимости от типа плазмиды). Для подроста нетрансформированных дрожжей использовать YPD.
  • п. 3.

  • Должны подрости до OD600>1.5.
  • п. 5.

  • Должны подрости примерно до OD600=0.5.
  • п. 6.

  • Можно осадить за несколько раз.
  • п. 11.

  • Для трансформации AD и BD плазмид можно использовать как одновременную трансформацию, так и последовательную. При последовательной трансформации сначала трансформируется одна плазмида, затем подращиваются трансформированные дрожжи в селективной среде, из них готовятся новые компетентные клетки и в них трансформируется вторая плазмида. Эффективность последовательной трансформации значительно выше, но требует дополнительного времени на подрост дрожжей после первой трансформации.
  • Непосредственно перед использованием денатурировать геномную ДНК в кипящей бане 10', сразу в лед.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100