Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Двугибридная система > Анализ активации репортерного гена LacZ.

Анализ активации репортерного гена LacZ.

Этот протокол используется для отбора клонов, положительных по активации гена LacZ, в дрожжевой двугибридной системе от Clontech.

  1. Приготовить Whatmann 3MM и фильтр по размеру чашки Петри;
  2. Положить без пузырей фильтр на поверхность чашки с дрожжевыми колониями;
  3. Осторожно снять фильтр с чашки и положить на поверхность жидкого азота колониями вверх, погрузить на 10'';
  4. Вынуть фильтр из азота и переложить на поверхность фильтровалки, колониями вверх;
  5. Приготовить свежий раствор "Z-буфер/X-gal";
  6. В пустую чашку Петри положить кусок Whatmann 3MM и смочить его 2.5ml раствора "Z-буфер/X-gal";
  7. Положить без пузырей на поверхность Whatmann 3MM фильтр колониями вверх;
  8. Инкубировать чашку 0.5-8h при 30oC и периодически проверять цвет колоний.

    Растворы.

    Z-буфер

    Конц.Сток50ml100ml200ml
    Na2HPO460mM1M3ml6ml12ml
    NaH2PO440mM1M2ml4ml8ml
    KCl10mM1M0.5ml1ml2ml
    MgSO41mM1M50µl100µl200µl
    H2O mQ44.45ml88.9ml177.8ml

    Z-буфер/X-gal

    Конц.Сток2.5ml100ml200ml
    Z-буфер1x1x2.5ml100ml200ml
    b-меркаптоэтанол0.3%100%7.5µl300µl600µl
    X-gal0.04%2%50µl2ml4ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 User Manual", Clontech.
  • По пунктам.

    п. 2.

  • Если это необходимо, сделать несколько проколов горячей иглой и отметить маркером их положение на обратной стороне чашки.
  • п. 3,4.

  • С замороженным фильтром надо обращаться очень осторожно. Фильтр становится очень хрупким и его легко сломать.
  • п. 4.

  • Фильтр должен полностью оттаять после жидкого азота. Обычно это занимает несколько минут. Только после этого фильтр можно класть на поверхность ватмана в п.7.
  • п. 6.

  • Объем раствора "Z-буфер/X-gal" берется таким, чтобы хорошо смочить Whatmann 3MM, но не образовывались "лужи" на его поверхности.
  • п. 8.

  • При значительном уровне экспресии b-галактозидазы колонии становятся синими уже через 15'. Если колонии начинают слабо синеть при времени инкубации более 8h, то их следует рассматривать как ложно-положительные сигналы.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100