Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Двугибридная система > Экспресс метод выделения pDNA из дрожжей.

Экспресс метод выделения pDNA из дрожжей.

Быстрый метод выделения плазмидной ДНК из дрожжей, для последующей электропорации E.coli.

  1. Посеять одиночную колонию в 5ml селективной среды и растить не менее 20h при +30°С;
  2. 1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку, ЦФ 1', удалить супер;
  3. Повторить п.2 еще 2 раза;
  4. Суспендировать осадок в 200µl лизирующего буфера;
  5. Добавить 0.3g стеклянных шариков и 200µl Ф:X:I;
  6. Вортекс 2';
  7. ЦФ 5', водную фазу перенести в новую пробирку и осадить этанолом (добавить 1/10V NaOAc pH5.2 и 2.5V EtOH);
  8. Осадок сполоснуть 70% EtOH, подсушить, растворить в 20µl 1xTE.

    Растворы.

    Лизирующий буфер

    Конц.Сток50ml100ml200ml
    Tris Cl, pH 8.010mM1M0.5ml1ml2ml
    NaCl100mM5M1ml2ml4ml
    SDS1%10%5ml10ml20ml
    Triton X-1002%10%10ml20ml40ml
    EDTA1mM0.5 M100µl200µl400µl
    H2O mQ33.4ml66.8ml133.6ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 User Manual", Clontech.
  • Плазмидная ДНК выделенная этим методом имеет сильное загрязнение геномной ДНК и РНК. Но ее вполне можно использовать для трансформации E.coli. Предпочтительно использовать электропорацию, так как выход плазмидной ДНК очень мал. Для электропорации достаточно 1µl выделенной плазмиды.
  • По пунктам.

    п. 1.

  • Мы обычно растим дрожжи в SD среде с необходимым набором аминокислот. Если необходимо, с добавлением антибиотиков. В богатой среде YPD можно растить только те плазмиды, которые достаточно стабильны и не теряются в процессе роста дрожжей.
  • п. 5.

  • Cтеклянные шарики - Sigma #G-8772 . Ф:Х:I - фенол:хлороформ:изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1, нейтральный pH.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100